融合蛋白EGFP-PPA原核表达及标记肿瘤细胞研究

肿瘤细胞糖基化改变是非常普遍的现象,与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一种甘露糖特异性结合凝集素,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein EGFP),通过基因工程技术形成融合基因,并在大肠杆菌中表达纯化了EGFP-PPA融合蛋白。实验结果表明,此融合蛋白可以识别实体肿瘤细胞表面的一部分标志,如Hep3B、Hu7、PLC、BEL-7404以及A549,而不能识别肝正常细胞L02,提示实体瘤细胞表面显露的甘露糖残基被此融合蛋白所识别,说明PPA识别具有甘露糖表型的实体瘤细胞表面的一部分,这些实验结果为进一步阐明甘露糖显露细胞在肿瘤发生发展中的作用提供了新的研究手段。     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导KG-1细胞凋亡的机制研究

研究蛋白酶体抑制剂MG132对人急性髓性白血病细胞株KG-1的致凋亡作用及其对细胞内信号传导因子NF-kB与凋亡蛋白PARP表达的影响.采用（CK-8法检测MG132对KG-1细胞增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色法,从形态学上观察凋亡的KG-1细胞;Western blot检测NF-kB活性及与凋亡相关的蛋白变化情况.CCK-8法检测结果表明,MG132能明显抑制KG-1细胞生长,并呈现时间依赖性和浓度依赖性;Hoechst染色和Western blot检测实验证明,MG132诱导KG-1细胞发生凋亡的同时,NF-kB活性明显降低,细胞凋亡蛋白PARP降解为P89蛋白.以上结果显示,MG132能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制NF-kB信号转导通路,下调NF-kB表达继而增加凋亡蛋白PARP剪切有关.     

人端粒酶RNA突变对HeLa细胞作用

端粒存在于真核生物染色体末端,由特定的DNA重复序列及与之特异性结合的蛋白质构成。在正常人体细胞中,每一次细胞分裂,由于DNA复制时的方向必须是从5’到3’端,因而伴随着染色体末端的端粒逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时,细胞开始走向凋亡。同时,端粒能在端粒酶作用下延伸,利用自身的RNA为模板合成端粒DNA。文章通过突变端粒酶RNA靠近模板的序列碱基A^61 A^62／GG以及G^63 G^64／AA,构建穿梭质粒,转染HeLa细胞,研究端粒酶位点突变对细胞生长的影响。研究结果显示不同的突变位点对HeLa细胞分裂活性有明显影响,这为深入研究肿瘤的分子遗传机制提供参考。