非生物胁迫因子对大豆Sali3-2基因的调控作用

通过生物信息学方法对Sali3-2基因上游非编码区序列(-1 945/+1)中的顺式作用元件进行预测.发现该序列中存在铜响应元件、干旱胁迫响应元件及与低温等非生物胁迫相关元件等.在不同非生物胁迫条件下,分别对转基因烟草悬浮细胞和转基因拟南芥幼苗中Sali3-2启动子片段驱动报告基因β-葡萄糖苷酸酶( β-glucuronidase,Gus)的表达进行分析.结果表明,在转基因烟草细胞和拟南芥幼苗中,Gus基因的表达明显受Al3+胁迫的诱导和Cu2+过多的抑制;在转基因烟草细胞中,该基因的表达一定程度上受脱落酸、渗透胁迫和盐胁迫的诱导,研究结果为了解Sali3-2基因的功能及调控作用奠定了基础.     

利用酵母表达体系研究大豆SALI3-2蛋白功能

以含有大豆Sali3-2cDNA的重组载体为模版,扩增出SALI3-2蛋白及其缺失信号肽的SIcDNA片段,构建酵母表达载体pYES2/S、pYES2/SI以及可表达SALI3-2-His6的pYES2/SH.空载体pYES2/ct和重组载体在转化酿酒酵母INVSC1后得到相应的酵母重组子INV/CK(对照菌)、INV/S、INV/SI和INV/SH.Westernblot实验结果表明,SALI3-2蛋白在酵母INVSC1中可被半乳糖诱导表达.对INV/CK、转基因的重组菌INV/S、INV/SI在无胁迫、含1.5mol/LNaCl或山梨醇培养基中的生长情况进行分析.结果表明,大豆SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达对无胁迫条件下酵母的生长没有影响,而在NaCl胁迫下可明显提高酵母转化子的耐盐能力.信号肽的缺失使SALI3-2蛋白的耐盐能力有所下降,可见信号肽对该蛋白耐盐功能的发挥有重要作用.另外,SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达不能提高酵母重组子的抗渗透能力,表明SALI3-2蛋白对细胞不具有明显的渗透胁迫调节作用.     

大豆耐盐相关基因的分离及其功能鉴定

利用大肠杆菌功能表达体系,从大豆开花40d未成熟种子的cDNA表达文库中筛选获得了11个耐盐相关cDNA克隆.对其中3个克隆的插入片段进行测序.结果显示,其中的Gm1013为一尚未报道的新基因片段;GmRPS25 2编码的蛋白质序列与西红柿40S核糖体蛋白S25有91%的同源性;GmAIP 2编码的蛋白质序列与大豆根铝诱导蛋白SALI3 2有97%的同源性.其中GmAIP 2可表达分子量为30 8kD的多肽.pET GmAIP 2转化后的大肠杆菌在含800mmol/LNaCl和700mmol/LKCl的液体培养基中生长状况明显好于对照菌,即前者表现出较短的生长迟滞期和较高的生长量.     

大豆子叶细胞中变形质体的形成和发育过程

质体是植物细胞中特有的一种细胞器。原质体、白色体、叶绿体和有色体之间的发育有着密切的关系。变形质体是一类不规则形状的原质体,多呈哑铃形、马蹄形或杯状。前人曾在许多植物的多种组织中看到过变形质体。但是关于变形质体的作用和进一步发育趋势目前尚无一致的看法。本文采用常规透射电镜技术观察了大豆子叶细胞中变形质体的形成和发育途径。结果和讨论:开花后19天的大豆子叶细胞中有许多原质体。其中部分原质体呈圆球形(图1)。部分原质体呈哑铃形(图2)、马蹄形(图3)和环形。从三维空间进行分析,马蹄形质体是杯状质体的一个     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3（late embryogenesis abundant group3）蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15 000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量（13 600）接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500 mmol/L NaCl和1 200 mmol/L 山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500 mmol/L NaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌（BL21/pET28a）的存活率;在含1 200 mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.     

大豆PM2蛋白及其结构域可提高烟草耐盐性

深圳市微生物基因工程重点实验室已利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆PM2蛋白（LEA3）的耐盐功能，并首次证实PM2蛋白序列中的22-氨基酸结构域（PM2B）为一主要耐盐结构域．为在高等植物中进一步验证PM2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能，将大豆PM2及PM2B基因克隆至植物表达载体pB1121，并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘，通过PCR扩增法鉴定转基因植株．结果表明PM2及PM2B基因已整合至转基因烟草的基因组DNA中，转化率分别为44．4％和62．5％．与含1．5％（质量分数）NaCl的培养基比较，转基因烟草植株的生长状况和叶片的叶绿素含量，结果表明转PM2和PM2B基因的烟草耐盐性明显高于对照（转化pB1121载体）植株．这说明转PM2和PM2B基因可提高烟草的耐盐能力．可见，PM2蛋白及22-氨基酸结构域在原核和真核细胞中的耐盐保护作用可能是相似的．