RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的序列进行了调取.根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3'RACE(Rapid-Amplification of eDNA 3'Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3'端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp.这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3'末端的序列的调取提供了参考.     

纳豆制备过程中大豆异黄酮的转化条件

使用日本古法制备纳豆,从纳豆中分离筛选出高活性的纳豆菌为实验菌株。研究了纳豆制备过程中大豆异黄酮的转化情况,发酵液中的大豆异黄酮在大豆异黄酮糖苷酶的水解作用下水解掉侧链糖基,转化为活性更高的大豆异黄酮苷元。根据薄层层析法确定了大豆异黄酮转化为大豆异黄酮苷元的最佳培养条件:培养温度为37℃,培养时间2 d,pH 7.0,含水质量分数60%。发酵液中大部分的大豆异黄酮苷转化为大豆异黄酮苷元,从而得到更利于人体吸收的大豆异黄酮苷含量较高的纳豆制品。     

酶解产物人参皂苷Rh_2、Rh_3的二氯甲烷层析分离

人参皂苷Rh2、Rh3具有一定的抗癌作用,而这些稀有皂苷在传统红参中的含量甚微。为了获得纯度较高的人参皂苷单体,将人参二醇类皂苷经酶转化等方法处理,得到以人参皂苷Rh2和Rh3为主的混合物。常压下,用二氯甲烷-甲醇作为洗脱液变换梯度进行硅胶柱分离,分别采用流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.10、7∶0.13、7∶0.15、7∶0.18、7∶0.2、7∶0.3渐变梯度进行洗脱,当流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.3时,成功分离出人参皂苷Rh2和Rh3。经高效液相色谱检测,为反式的二十、二十二碳烯Rh3和顺式的二十、二十二碳烯Rh3(即Rk2)混合物,纯度达到95%以上;也得到较纯的Rh2,经高效液相色谱检测为20(S)-Rh2和20(R)-Rh2异构体的混合物,纯度达到85%以上。     

人参皂苷Re的分离提纯

采用硅胶柱层析法分离人参叶三醇皂苷,以氯仿-甲醇为流动相洗脱,得到了纯度较高的人参皂苷Re。结果表明,利用硅胶柱层析柱从35 g叶三醇皂苷中分离得到人参皂苷Re7.36 g,得率为21.03%。采用重结晶法对经硅胶柱分离制备的5 g Re进行提纯,将结晶产品分开收集,第2次结晶效果最好,得产品2.43 g,得率为48.68%,纯度为98.89%。     

酶反应产物中人参稀有皂苷F2与C-Mc的分离

原人参二醇类皂苷混合物经人参皂苷酶生物转化后可生成F2、C-Mc等7~10种稀有人参皂苷。天然人参中不含人参皂苷C-Mc,且F2的含量极低。在生物转化所得的人参二醇类皂苷酶反应产物中,分离纯化得到稀有人参皂苷F2与C-Mc,并进行HPLC检测。反应后得到粗产品40g,经脱糖脱色和硅胶柱分离后,成功得到稀有人参皂苷F23.49g,纯度为98.2%,得率8.72%;得到C-Mc 0.70g,纯度为82.2%,得率为1.80%。成功分离出了F2和C-Mc制品,建立了初步的分离制备方法。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁 α 鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidiasp.R9g的总RNA出发,通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)扩增出芦丁 α 鼠李糖苷酶基因片段。将RT PCR获得的1条1.6kb的目的条带与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

酶转化制备人参皂苷Rg2及其对巨噬细胞增殖分化的影响

利用Absidia sp.G8r菌产酶液,以人参皂苷Re为底物进行酶转化制备人参皂苷Rg2。采用硅胶柱层析法分离纯化人参皂苷Rg2,探讨了人参皂苷Rg2对巨噬细胞增殖及单核-巨噬细胞分化的影响。结果表明,人参皂苷Re转化为Rg2,酶转化率为66.3%。硅胶柱层析法对产物分离纯化,得到高纯度Rg2,HPLC检测纯度达95%,得率为13.1%。人参皂苷Rg2对巨噬细胞增殖分化的研究表明,低质量浓度(25～100μg/mL)对巨噬细胞的增殖抑制作用不明显,高质量浓度(大于100μg/mL)时对巨噬细胞的增殖抑制作用明显;当Rg2质量浓度为100μg/mL时,能促进单核-巨噬细胞的分化。     

丹参药渣中丹参酮ⅡA的分离纯化

丹参药渣是丹参和三七等混合水浸后的残留物。本文以乙醚为溶剂,从丹参药渣中提取丹参酮,用硅胶柱层析法分离纯化丹参酮ⅡA。结果表明,丹参药渣乙醇提取物,经乙醚提取获得的丹参酮复合物得率为29.2%;丹参酮复合物经硅胶柱层析法分离、浓缩、结晶,得到纯品丹参酮ⅡA,利用高效液相色谱法检测丹参酮ⅡA纯度为96%。     

从皂苷糖基水解酶产生菌sp.48g提取基因组DNA

采用试剂盒法、饱和酚抽提法、高盐沉淀法和氯化苄法从皂苷糖基水解酶产生菌sp.48g提取基因组DNA。经比色法和琼脂糖凝胶电泳分析检测。结果用氯化苄法提取的基因组DNA在质量上和得率上优于其他方法。A260/A280为1.7,DNA产量为0.11mg/g湿菌体。达到下部实验要求。     

虎眼万年青总皂苷中单体皂苷的分离纯化

虎眼万年青总皂苷中含有很多皂苷组分,为了得到虎眼万年青单体皂苷,采用硅胶柱层析法分离虎眼万年青总皂苷,以氯仿-甲醇混合液为流动相进行洗脱,TLC跟踪检测。5 g虎眼万年青总皂苷进行硅胶柱层析分离,TLC检测,得到5种虎眼万年青皂苷的单体组分,得率分别为2.6%、2.6%、3.6%、5.4%、12.6%。超高压液相色谱检测,分离效果相对较好的是D、E组分。结果表明,采用硅胶柱层析的方法可以初步达到分离纯化虎眼万年青皂苷的目的。