脊髓灰质炎病毒与痘苗病毒重组体的构建及表达

含脊髓灰质炎病毒1型(简称 PV1)全基因7.4Kb cDNA 和编码 PV1外壳蛋白 VP12.5Kb 的 cDNA 片段的两株重组痘苗病毒(RV-1和 RV-2)表达了 PV1抗原。经荧光标记的抗 PV1型特异性单克隆抗体检测,感染了 RV-1和 RV-2的 Herp-2细胞呈阳性荧光反应。免疫印迹实验证实两株重组痘苗病毒分别表达 PV1抗原三条和两条特异性蛋白带。免疫家兔后能诱导产生抗 PV1中和抗体。本文对重组病毒表达 PV1抗原的效率进行了初步讨论。     

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。     

应用核酸探针检测甲型肝炎疫苗的滴度

应用甲型肝炎病毒(HAV)cDNA 片段作为探针,分别以同位素、异羟基洋地黄毒苷配基和生物素标记该探针,对甲肝疫苗病毒培养过程中不同时期、不同接种量的病毒浓度进行了滴定,并以 ELISA 作对照。结果表明,各种标记探针检测的灵敏度均高于 ELISA。而不同标记的探针检测的结果无显著差异。     

定位诱变脊髓灰质炎疫苗株VP1壳蛋白提高疫苗的热稳定性

本文首次在脊髓灰质炎疫苗株VP1壳蛋白上用计算机探索了氨基酸取代对热稳定性的影响。Menendez-Arias等研究发现,使蛋白质α-螺旋区内刚性(螺旋趋势)增加,亲水性减少,能适应更热的环境。而少数几个氨基酸的取代则能实现这种改变。本文运用本室建立的蛋白质二级结构预测的计算机程序在VP1壳蛋白上寻找α-螺旋区,选择出亲水概率大的并与中和抗原决定簇区无关的α-螺旋区作为氨基酸取代的区域。在这些区域上进行了有效的几个氨基酸取代后,均能使α-螺旋趋势增加,亲水性减少,而取代部位两侧氨基酸残基构型基本上没有发生变化,这与文献报道的结果是一致的。这项工作可为将来利用基因工程方法,设计、寻找工程蛋白提高脊髓灰质炎疫苗的热稳定性提供理论依据。     

表皮生长因子对脊髓灰质炎病毒增殖的影响

在细胞培养维持液中,加入人表皮生长因子(h-EGF),观察在不同温度下、不同浓度EGF 对脊髓灰质炎病毒生长繁殖的情况。结果发现,维持液中加含10～100ng/ml EGF,能获得最高感染滴度,高于100ng/ml 则有所下降,5ng/ml 时与对照组无差别。在36℃培养的滴度高于33℃,病毒滴度变化与温度呈平行关系。所培养的子代病毒,可被抗脊髓灰质炎Ⅰ型血清中和。10ng～100ng/ml 浓度的 EGF 对细胞不产生毒性作用。     

人单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV—Ⅱ)感染树鼩的超微结构研究

树鼩作为一种新的实验动物在医学生物学方面的应用已越来越广泛。我们进行了HSV—Ⅱ感染树鼩的实验研究。现将其超微结构观察结果报告于下: 材料和方法 HSV—Ⅱ滴度为10~5TCD50/ml。树鼩由云南禄劝县捕获。感染途径分腹腔内注射和阴道填充,感染量为0.05至0.1ml。同时设腹腔注射和阴道填充无HSV—Ⅱ的兔肾细胞培养液作为对照。感染后第5天处死动物。分别取腹腔感染3只、阴道感染2只和两种途径对照组各一只动物的心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓作常规超薄切片制样,电镜观察。     

重组人IL- 18的高效表达、纯化及诱导KG—1细胞产生高水平IFN-γ

目的 研究IL－18在大肠杆菌中高效表达及纯化工艺，并诱导KG－1 细胞产生IFN－γ。 方法利用RT－nPCR从正常人胎肝组织中扩增获得人IL－18基因，克隆于pThiohisA载体，转化宿主菌BL－21，1mmol/LIPTG；诱导，表达产物以包涵体形式存在，经2％Triton X－100洗涤，在 8mol/L尿素下变性阴离子柱层析，透析复性后再经凝胶过滤纯化，通过纯化产物诱导入骨髓瘤单核细胞 KG－l（ATCC CCL－246）产生 IFN－γ，并检测其生物学活性。结果 获得了在大肠杆菌中的稳定高效表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的25％左右，纯化后纯度可达95％以上，具有显著的刺激细胞产生IFN－γ的活性。结论 制备具有生物学活性高纯度的rhIL－18方法的建立，为基础研究与临床应用开发奠定了基础。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

轮状病毒低温传代后生物学特性的研究

本文报道了动物轮状病毒(RV)SA_(11)及 NCDV 株经低温传代后生物学特性变化。这两个毒株分别属动物 RV 第3和第6血清型。本实验室用非洲缘猴肾细胞(BGMK)作为基质,将两株病毒连续传代,选择起始温度36℃,每传10代降低3℃,最终在29℃传20代,总传代数为50代。低温传代后的毒株,血凝活性明显下降,对组织培养感染性在39℃时,冷适应株低于原始株,血清中和试验表明:传代后毒株抗原性稳定,SA_(11)株具有良好的遗传稳定性。NCDV 株在传代过程中第5基因片段发生变异。     

甲醛灭活型间嵌合脊髓灰质炎病毒免疫原性的研究

应用基因工程重组技术构建了脊髓灰质炎型间嵌合病毒xF_(233)(I/Ⅲ型)。经浓缩、提纯及甲醛灭活3天和12天,虽然其细胞感染力已全部丧失,但仍能诱导家兔产生高效价的抗-Mahoney和抗-Leon血清中和抗体。说明xF_(233)有可能作为灭活疫苗的候选株。