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pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析分离人胰高血糖素样肽-1融合蛋白的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的探讨pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)分离含His-Tag标签的人胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白的影响,并确定最佳洗脱条件。方法在0.50mol/L盐浓度条件下,分别取pH6.0、7.0、7.8和9.04种缓冲液进行咪唑梯度洗脱;在合适的pH值条件下,分别取氯化钠浓度0.25、0.50和0.75mol/L3种缓冲液进行咪唑梯度洗脱。分析在不同pH值及盐浓度条件下洗脱融合蛋白所需要的咪唑浓度及回收率。结果在所考察的pH值范围内,洗脱融合蛋白所需的咪唑浓度随洗脱液pH值的升高而逐渐降低,当洗脱液pH值为7.8时,融合蛋白的分离效果最佳,大部分杂蛋白被0~40mmol/L咪唑洗脱液去除且不含融合蛋白,而绝大部分融合蛋白在咪唑浓度达80~200mmol/L时被洗出,总回收率达(83.7±1.0)%,且比例较高;在此pH值条件下,氯化钠浓度达0.75mol/L,才会影响融合蛋白的回收率,氯化钠浓度为0.25或0.50mol/L的洗脱液洗出融合蛋白的效果相近;在pH7.8,含0.25mol/L氯化钠的洗脱体系下,用50mmol/L咪唑溶液洗脱杂蛋白,200mmol/L咪唑溶液洗脱融合蛋白,融合蛋白的回收率和比例分别可达(85.2±2.0)%和(80.5±1.0)%。结论在所考察的pH值和盐浓度范围内,提高洗脱液pH值和盐浓度均可降低洗脱融合蛋白需要的咪唑量,但也会降低融合蛋白的回收率。 相似文献
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基于细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)的细胞疗法是癌症治疗的关注热点之一,获得足够数量具有功能的效应细胞是临床应用的重要环节,而实现效应细胞高密度培养,减少培养体积,是降低治疗成本的有效途径。黄原胶作为一种信号分子,具有调控细胞增殖的活性。为此,以外周血单个核细胞为研究对象,以总细胞扩增倍数、效应细胞比例和扩增倍数,以及扩增后CIK细胞对K562细胞的杀伤活性为评价指标,考察了黄原胶对CIK细胞体外高密度扩增的影响。结果显示:当接种密度为4×106 cells×mL~(-1)时,在含有100μg×mL~(-1)黄原胶的无血清培养基中,总细胞扩增倍数可达到150.0±29.1,显著高于不含黄原胶对照组的41.1±5.1(p0.05);CD3+CD56+细胞的比例和扩增倍数分别为(16.7±7.6)%和321.4±48.6,显著高于对照组的(13.2±6.8)%和71.4±31.3(p0.05);而且添加黄原胶时扩增后CIK细胞对K562细胞杀伤活性的均值可从28.7%增加到34.3%。该研究结果可为CIK细胞体外扩增过程的优化提供技术支持。 相似文献
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软骨组织工程生物支架材料的内部结构(如孔结构)对于细胞行为有着重要影响。3D打印技术可以实现对支架结构的精确控制。聚己内酯(poly(ε-caprolactone),PCL)是广泛应用的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性,支持多种细胞的黏附、增殖和基质分泌。3D打印制备的PCL多孔支架包含相邻三部分,每部分由六层纤维堆积,相邻两层的纤维夹角分别为30、45和60°,而同层中纤维间距为分别为450、400和300μm;力学性能测试梯度支架的杨氏模量在47 MPa左右,与天然软骨组织20 MPa相匹配;微断层扫描和扫描电镜观察支架表面和内部形貌的结构特征,Image J软件对支架特征参数进行量化分析。支架表面和内部形貌规整,呈现孔结构梯度分布,具有良好的孔连通性和57%左右的孔隙率,孔径梯度大小为342~747μm。经细胞接种培养后,应用扫描电镜、CCK8检测和死活染色方法分析支架材料对细胞生长及活性的影响。梯度支架能够很好地支持细胞生长和活性。研究通过对支架材料的设计和制备为软骨组织工程研究奠定了基础。 相似文献
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AQC柱前衍生高效液相色谱法测定动物细胞培养基中氨基酸 总被引:1,自引:0,他引:1
以α-氨基丁酸为内标,6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯为柱前衍生试剂,用高效Nova-Pak C18柱,乙酸钠溶液(pH5.70)和60%乙腈为流动相,采用二元梯度洗脱,紫外检测器在248nm波长检测,建立了一种新的柱前衍生反相HPLC法同时测定动物细胞培养基中谷氨酰胺在内19种氨基酸.方法重现性好,精密度高.氨基酸的峰面积-浓度线性范围为20~500 μmol/L,线性相关系数均大于0.99,峰面积的精密度为1.55~10.8%.在该色谱条件下获得了良好的商用细胞培养基DMEM和F12中氨基酸的色谱图,为动物细胞生长代谢研究提供了有利的实验手段. 相似文献
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采用改良双层板方法从酸性矿坑水(AMD)中筛选、鉴定并命名为氧化效果最佳的分离株—嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)LJ-02。当温度在36~46℃范围内,矿石氧化率呈现出先升后降的趋势;降低pH对提高细菌氧化能力有着显著影响;在接种量不超过10%(v/v)的条件下,接种量的提高有利于矿石的生物氧化。该菌株对难处理金矿的吸附属于Langmuir等温吸附,其吸附平衡常数为8.72"10-10 mL/cells,单位质量矿物颗粒的最大吸收能力为1.99"109 cells/g。 相似文献
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低温冷冻对CIK细胞诱导及活性影响的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 研究低温冷冻对CIK(cytokine-induced killer cells)细胞诱导及活性的影响,方法 用经过程序降温仪冷冻后的脐血单个核细胞定向诱导CIK细胞,其活性与用新鲜的脐血单个核细胞定向诱导生成的CIK细胞进行比较,并对冷冻过的经21d诱导生成的CIK细胞,与未冻存过的细胞进行活性比较。用乳酸脱氢酶(LDH)分析法分析细胞毒活性,用流式细胞分析仪分析CIK细胞的纯度。结果 冻存后的脐血单个核细胞诱导生成的CIK细胞在扩增能力、纯度和细胞毒性方面与新鲜细胞诱导生成的CIK细胞无明显差异;经过冻存的CIK细胞在纯度和细胞毒性方面与未冻存前也无明显差异。结论 对于CIK细胞的临床应用具有指导意义。 相似文献
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目的筛选扩增培养前后脐血CD34+细胞差异表达基因。方法将新鲜分离的CD34+细胞设为对照组,经静态和动态培养系统扩增的CD34+细胞设为试验组,应用基因差异显示技术(DDRT-PCR)比较两组之间的基因表达差异,对差异表达基因片段进行克隆、测序及生物信息学分析,并且通过半定量RT-PCR方法验证基因差异表达的真实性。结果应用差异显示技术筛选出5个差异表达基因,其中4个为已知功能基因,1个为未知功能基因,对其中2个基因RAN和DC24进行半定量RT-PCR检测表明,在静态和动态体系扩增培养后的CD34+细胞内,RANmRNA的表达水平分别是新鲜分离细胞的1.521和3.978倍,DC24mRNA的表达水平分别是新鲜分离CD34+细胞的14.275和2.374倍。结论发现了与CD34+细胞体外增殖相关的一些重要基因,为从基因水平调控CD34+细胞体外增殖提供依据。 相似文献
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氨基酸的浓度与配比对细胞生长和产物表达有重要作用。在自主研发无血清培养基的基础上,通过单纯型格子实验设计优化氨基酸浓度及配比后发现,优化的无血清培养基明显促进了细胞生长。生物反应器批式培养中,最高活细胞密度达52.6×105 cells·mL-1,抗体融合蛋白产量52.2 mg·L-1,相对于商业培养基Ex-cell 302,分别提高了26.7%和11.5%。在此基础上,通过部件搜索的方法确认具有显著正影响的氨基酸为谷氨酰胺、脯氨酸和甲硫氨酸。基于上述研究工作,在2 L反应器采用自主研发的优化无血清培养基,以葡萄糖为关键控制参数,进行两阶段动态流加培养过程,CHO细胞最大活细胞密度达94.6×105 cells·mL-1,抗体融合蛋白终产量600 mg·L-1,相对于商业培养基Ex-cell 302批式培养,分别提高了2.75倍和11.8倍。本研究工作为抗体融合蛋白的高效工业化生产奠定了基础。 相似文献
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为了研究层流剪切力对造血干细胞体外扩增及向各系造血祖细胞分化的影响,考察了在3组不同大小层流剪切力0、0.03、0.06 Pa的作用下,CD34+细胞为起始细胞的造血干/祖细胞体外扩增和向各系祖细胞分化的情况.结果表明:3组总细胞、CD34+细胞及CD34+38-细胞的扩增无显著性差异;0.03 Pa层流剪切力使造血干细胞更易于向红系祖细胞系分化;0.06 Pa层流剪切力使其更易于向粒-巨噬祖细胞系分化;无层流剪切力作用下造血干细胞更易于向混合系祖细胞系分化. 相似文献