人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。     

太阳能地板辐射暖棚禽舍的设计

分析了我国暖棚禽舍的现状和现行技术存在的问题，参照太阳能地板辐射采暖技术提出了改进我国暖棚禽舍的设计思路，并分析了蛇、鸡、牛的养殖在改进后的效果。     

微乳液最佳中相醇用量和增溶能力与油相等效烷基碳数的定量关系

主要考察了十八烷基三甲基氯化铵(OTAC)和十二烷基硫酸钠(SDS)对油相的增溶规律。通过不同烃类混合,包括两种烃类的混合和4种烃类混合,调整混合油相的等效烷基碳数(EACN),探索最佳中相醇用量(A*)、最佳增溶量(SP*)与EACN的关系。A*、SP*与EACN在两类表面活性剂条件下都呈现二次函数的关系,且在同一表面活性剂体系中,控制其他组分含量恒定的情况下,函数关系与所用的烃无关。     

碳纳米管-石墨烯气凝胶制备及其对水中乳化油的吸附特性

以改进的Hummers-Offeman法制备出的氧化石墨（GO）与羧基化多壁碳纳米管（CNTs-COOH）为原料,聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为交联剂,乙二胺（EDA）为还原剂,水热还原法制得羧基碳纳米管-石墨烯复合气凝胶（CGA）。调整GO与CNTs-COOH的质量比获得密度在8.40～14.42 mg·cm^-3之间的气凝胶,并确定在GO：CNTs-COOH=3：1（质量）时得到的气凝胶的机械强度最优。通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）对所制备的CGA进行表征,得知GO与CNTs-COOH已成功还原组装成多孔状三维气凝胶结构。以水中乳化柴油作为研究对象,考察CGA样品在不同温度下对乳化柴油的吸附特性。结果表明,CGA的吸附量在前6 min迅速上升,在30 min左右达到吸附平衡,且平衡吸附量随温度升高而增加。吸附过程遵循准二级动力学模型,体系表观活化能为7.10 kJ·mol^-1。利用颗粒内扩散模型分析得出,CGA对乳化油的吸附分为外表面吸附过程和内部孔道吸附过程（内部大孔道吸附、中孔道和微孔道内扩散3个阶段）。     

HPV 16 L1天然变异体在毕赤酵母中的可溶性表达及病毒样颗粒装配

目的在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异。方法将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体p Pink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株p Pink strain 1。重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性。经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况。通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列。结果两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确。两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而M16呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力。Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、Δ424S、D441Δ、K452Q)。结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得。提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造。     

大肠埃希菌外膜囊泡作为新型外源质粒递送载体的研究

目的探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为新型DNA疫苗递送载体的潜力及价值。方法从大肠埃希菌DH5α的培养上清中经过滤、超滤、超速离心等步骤收集天然分泌的OMVs,采用密度梯度离心法纯化OMVs。将纯化后的OMVs与哺乳动物吞噬细胞及非吞噬细胞进行体外孵育,观察不同细胞对OMVs的摄取效率。通过电击转化方式将带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP转入OMVs中,并与RAW264. 7细胞共孵育,观察OMVs携带真核表达质粒进入细胞并表达绿色荧光蛋白的情况。结果密度梯度离心法可有效纯化OMVs,纯化后的OMVs进入不同哺乳动物细胞的效率不同,进入吞噬细胞的效率高于非吞噬细胞,经电击转化后,质粒DNA可被导入OMVs中,并随吞噬细胞摄取及表达。结论约5 300 bp的真核表达质粒可用电击方式导入OMVs中,并通过OMVs介导该质粒在吞噬细胞中表达,提示OMVs具有作为新型质粒DNA递送载体的潜力。     

E.coli表达HEV ORF2编码蛋白第112～607氨基酸片段的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性

目的 探讨E.coli表达的戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码蛋白第112～607氨基酸片段(pORF2-56K)的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性。方法 pORF2-56K免疫小鼠和豚鼠,用ELISA检测血清抗体效价。将HEV毒种与高效价豚鼠灭活血清在体外孵育后,接种于2BS细胞,用RT-PCR检测病毒RNA的复制情况。结果E.coli表达的pORF2-56K可诱导机体产生高水平的HEV特异性抗体和强烈的免疫记忆。该抗体可在体外有效中和HEV,使之失去在2BS细胞中有效复制的能力。结论 E-coli表达的pORF2-56K具有良好的免疫原性,且其诱生抗体具有中和HEV的能力,可作为HEV重组疫苗的候选抗原。     

碳纳米管-石墨烯气凝胶制备及其对水中乳化油的吸附特性

以改进的Hummers-Offeman法制备出的氧化石墨(GO)与羧基化多壁碳纳米管(CNTs—COOH)为原料,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为交联剂,乙二胺(EDA)为还原剂,水热还原法制得羧基碳纳米管-石墨烯复合气凝胶(CGA)。调整GO与CNTs—COOH的质量比获得密度在8.40~14.42 mg·cm~(-3)之间的气凝胶,并确定在GO:CNTs—COOH=3:1(质量)时得到的气凝胶的机械强度最优。通过扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)对所制备的CGA进行表征,得知GO与CNTs—COOH已成功还原组装成多孔状三维气凝胶结构。以水中乳化柴油作为研究对象,考察CGA样品在不同温度下对乳化柴油的吸附特性。结果表明,CGA的吸附量在前6 min迅速上升,在30 min左右达到吸附平衡,且平衡吸附量随温度升高而增加。吸附过程遵循准二级动力学模型,体系表观活化能为7.10 k J·mol~(-1)。利用颗粒内扩散模型分析得出,CGA对乳化油的吸附分为外表面吸附过程和内部孔道吸附过程(内部大孔道吸附、中孔道和微孔道内扩散3个阶段)。     

垂直Bridgman法生长碲锌镉晶体的数值模拟分析

利用FIDAP数值软件,详细地模拟分析了垂直Bridgman法生长碲锌镉晶体过程,讨论了碲锌镉材料潜热释放及熔体对流对安瓿边界的温场分布的影响,分析了5 K/cm、10 K/cm、15 K/cm三种不同温度梯度条件对固液界面的影响.结果表明:在所采用的模型计算条件下,潜热释放及熔体对流对安瓿边界的温场分布有很小的影响;在生长初期和末期,固液界面变化比较剧烈;随着温度梯度的加大,在生长中期,界面凹向固态区的趋势减小,界面凹向液态区的趋势加大.     

重组人IL- 18的高效表达、纯化及诱导KG—1细胞产生高水平IFN-γ

目的 研究IL－18在大肠杆菌中高效表达及纯化工艺，并诱导KG－1 细胞产生IFN－γ。 方法利用RT－nPCR从正常人胎肝组织中扩增获得人IL－18基因，克隆于pThiohisA载体，转化宿主菌BL－21，1mmol/LIPTG；诱导，表达产物以包涵体形式存在，经2％Triton X－100洗涤，在 8mol/L尿素下变性阴离子柱层析，透析复性后再经凝胶过滤纯化，通过纯化产物诱导入骨髓瘤单核细胞 KG－l（ATCC CCL－246）产生 IFN－γ，并检测其生物学活性。结果 获得了在大肠杆菌中的稳定高效表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的25％左右，纯化后纯度可达95％以上，具有显著的刺激细胞产生IFN－γ的活性。结论 制备具有生物学活性高纯度的rhIL－18方法的建立，为基础研究与临床应用开发奠定了基础。