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1.
本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导转入p ET-30-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 k D,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 k D;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶(45.375μmol)的一个抑制活性单位为0.718μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。  相似文献
2.
本文综述了鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatins超家族的分类、结构及抑制机制,进一步根据其特性,提出Cystatin有望成为鱼肉品质相关候选因子,并且阐述了其在抑制鱼糜凝胶软化及水产品抑菌、保鲜等方面的应用前景.  相似文献
3.
以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。  相似文献
4.
通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)粗提过程中的比活力(Azocasein法),确定其最佳粗提条件为:以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)作为匀浆缓冲液,并于30℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22倍。采用Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10倍和1 769.23 U/mg、502.62倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度(48.77%和55.55%),抑制软化。  相似文献
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