蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响

目的:通过模拟肠胃液消化试验,分析锯缘青蟹肌肉中过敏原(原肌球蛋白)的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响.方法:采用美国药典提供的模拟胃、肠液配方,测定青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性.以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行分析.结果:在模拟胃液反应中,非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白等被胃蛋白酶快速降解,而原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解.在模拟肠液反应中,相对于致敏蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解,原肌球蛋白尽管120 min后几乎被完全分解,但会产生一些较稳定的蛋白降解片段.以免疫印迹法检测过敏患者血清,结果分子质量为34 kDa的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性.结论:蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应.  

水产食品中组胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色谱测定方法的建立及应用

建立一种快速测定水产食品中组胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色谱方法。该方法中样品经三氯乙酸 提取、丹磺酰氯衍生，C18反相色谱柱分离，以70%乙腈和30%超纯水为流动相进行等度洗脱，254 nm波长处紫外检 测。结果显示，组胺保留时间为5.5 min，组胺在1～500 μg/mL范围内线性系数为0.999 9，仪器检出限（RSN=3）为 0.5 μg/mL，定量限（RSN=10）为1.0 μg/mL，且重复性良好；采用该方法测定了16 种水产品和19 种水产加工食品中 的组胺，结果显示含量在0～682.22 mg/kg之间；样品添加不同质量浓度组胺的回收率为89.54%～101.92%。结果表 明，该方法快速准确、灵敏度高、重复性好，适用于水产食品中组胺的测定。采用该方法检测了鲣鱼、鲭鱼和蓝圆 鲹在不同温度条件下的组胺变化情况，结果发现，3 种鱼在低温贮藏条件下的组胺含量明显低于高温贮藏条件下的 含量，表明低温贮藏可有效抑制组胺产生。  

九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

采用SP-Sepharose阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析、Sephacry S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析和Hydrox-yapatite羟基磷灰石柱层析,从九孔鲍鱼(Haliotis diversicolor)消化腺中分离纯化到一种纤维素酶.SDS-PAGE结果显示,该酶的分子质量约为55kDa.该酶水解解甲基纤维素钠的最适温度50℃,最适pH5.5.该酶在温度40℃以下,pH50～7.0之间具有较好的稳定性.  

鲍鱼内脏中天然牛磺酸的提取与检测

目的 以皱纹盘鲍内脏为原料, 优化高纯度牛磺酸的提取工艺, 并建立用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法。方法 经水煮、乙醇抽提、蒸发浓缩、沉淀、活性炭处理、结晶等步骤, 获得高纯度天然牛磺酸。用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法为: 色谱柱: Discovery C18; 流动相: 甲醇-0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.3) (v/v, 50:50); 流速: 1 mL/min; 检测波长: 330 nm; 柱温: 室温。结果 该提取工艺能从 1 kg鲍鱼内脏中提取得到天然牛磺酸3.07 g。采用该检测方法, 牛磺酸的出峰时间为6.037 min, 在 1~20 μg/mL浓度范围内线性关系良好(R2=0.9999), 最低检出限为0.03 μg/mL, 最低定量限为0.12 μg/mL, 样品测定的平均回收率为99.44%(RSD=0.25%), 方法的精密度和稳定性好(RSD<1%), 用该方法检测提取得到的牛磺酸纯度为96.06%。采用红外光谱法(IR)对提取得到的鲍鱼内脏牛磺酸进一步作结构鉴定, 发现它与标准品的红外特征吸收峰一致。结论 获得了高纯度牛磺酸的提取工艺。本方法精密度和稳定性好, 回收率高。  

不同加工方式降低大黄鱼鱼卵过敏原及其 消化产物免疫反应性的比较研究

目的 本文以大黄鱼鱼卵为原料, 分析比较不同加工方式对大黄鱼鱼卵过敏原及其消化产物免疫反应性的影响。方法 采用不同加工方式(美拉德反应, 紫外照射, 超声联合加热, 高温高压)处理卵黄蛋白,制备粗提物并进行模拟胃肠液二相消化实验, 利用免疫印迹及抑制性ELISA方法对粗提物及消化产物中过敏原的IgG/IgE结合活性进行分析。结果 分析不同加工方式处理后卵黄蛋白中过敏原的IgG结合活性, 结果发现当抗体稀释倍数为4×10₄时, 检测不到美拉德反应产物与抗体发生特异性结合, 而经后三种物理加工方式处理后的粗提物均与抗体有不同程度的免疫反应。此外, 分析加工处理及其消化产物中过敏原与患者血清的IgE结合活性, 结果显示经不同加工方式处理后, 仅有美拉德反应产物的抑制率低于50%; 经高温高压处理的粗提物抑制率为65%, 但消化后其抑制率降至20%以下。结论 在4种不同的加工方式中, 美拉德反应能有效地降低大黄鱼鱼卵中过敏原的IgG/IgE结合活性, 超声联合加热及高温高压处理明显减弱过敏原消化产物的IgE结合活性, 紫外照射对过敏原的影响不明显。  

荧光法检测鱼糜制品中大豆蛋白的研究

鱼糜制品中大豆蛋白的过量添加已成为水产食品生产的一个新问题,建立有效的检测方法尤为重要.本研究通过丙酮浸泡、酸处理、硫酸铵盐析和柱层析等步骤分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibitor,STI)并制备抗STI单克隆抗体(A11-6).经过Protein G Sepharose柱层析分离得到高纯度的免疫球蛋白(IgG).采用SPDP(N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶)和DTT(二硫苏糖醇)组合处理,成功将R-藻红蛋白偶联到抗STI单克隆抗体.利用该荧光标记的抗体建立的免疫荧光法能够检测出鱼糜制品中的STI,检测限为1.56μg/mL,灵敏度略高于传统的化学发光法.该免疫荧光法具有操作时间短、灵敏度高和使用安全等优点.  

猪肌肉葡萄糖6-磷酸异构酶的分离纯化及性质研究

葡萄糖6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI;EC 5.3.1.9)能催化果糖6-磷酸(fructose-6-phosphate,F-6-P)异构为葡萄糖6-磷酸(glucose-6-phosphate,G-6-P),是糖原酵解过程中的重要酶之一.本研究通过硫酸铵盐析、DEAE-Scpharose、SP-Sepharose以及Hydroxyapatite层析等方法从猪肌肉中分离纯化得到GPI,纯化倍数为105.6,比活力为159.4U/mg.SDS-PAGE和凝胶过滤层析表明猪GPI为单体蛋白,分子量约为55kDa.免疫印迹检测结果显示,猪GPI能够和抗白姑鱼GPI多克隆抗体发生免疫交叉反应.酶学性质显示猪GPI的最适温度为50℃,最适pH为8.5.在pH 8.5、25℃条件下测得其Km值为0.39mmol/L,最大反应速率Vmax为0.61mmoL/L·min.  

翡翠贻贝副肌球蛋白的特性及在模拟胃肠液中的消化

为探究贝类副肌球蛋白（paramyosin，PM）的热稳定性、pH值稳定性及其在模拟胃肠液中的消化特性，以翡翠贻贝（Perna viridis）为对象，利用硫酸铵盐析和羟基磷灰石柱层析等方法，从肌肉中纯化PM，采用肽质量指纹图谱法对其进行鉴定，利用圆二色谱测定其二级结构及热变性温度。结果显示，翡翠贻贝PM分子质量为99.5 kDa；肽质量指纹图谱分析获得26 个肽段，共330 个氨基酸残基，与地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)PM的序列一致性达到100%，表明纯化的蛋白为PM。圆二色谱结果显示，PM呈现典型的α-螺旋结构，其热变性温度为（56.3±0.2）℃。在30～100 ℃热处理30 min，PM未出现沉淀聚集现象，在pH 6～11范围内也较稳定，但当pH≤5时稳定性差，出现沉淀聚集现象。与胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶对PM的单独消化作用相比，3 种酶连续作用可使PM有效降解，但仍有分子质量30 kDa的片段未被完全消化。本研究表明，翡翠贻贝PM具有较好的耐热性及耐消化性，为贻贝深加工及PM的后续研究提供一定理论参考。  

蓝圆鲹酸/碱等电点沉淀法分离蛋白凝胶特性与消化特性

采用酸/碱等电点沉淀（isoelectric solubilization/precipitation，ISP）法制备蓝圆鲹肌肉分离蛋白（acid/alkaline aided protein isolate，API/KPI），并对全蛋白（total protein，TP）、肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）与分离蛋白的理化特性、凝胶特性以及消化稳定性进行比较研究。结果表明，蓝圆鲹肌肉蛋白在碱性条件下溶解性显著高于酸性条件，经优化后的API与KPI的回收率分别为65.0%与84.6%，显著高于MP（54.0%）。KPI、API与MP的脂肪与灰分含量明显低于TP，其中KPI的粗蛋白含量最高。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示KPI与API的蛋白组成与TP相近，但KPI与API的氨基酸组成中甘氨酸与脯氨酸含量显著低于TP。质构与流变学分析结果显示，KPI与API的凝胶强度与储能模量（G’）均明显低于TP与MP，其中TP、MP与KPI的储能模量在50～55 ℃会出现明显的下降趋势，表明发生凝胶劣化现象，而API组无明显变化。扫描电子显微镜结果表明，与90 ℃相比，经55 ℃加热处理的KPI、TP与MP组凝胶结构更加疏松、多孔，这与流变学分析的结果一致。体外模拟胃肠液消化实验表明，MP具有最佳的消化性，API与KPI的消化性相当，且显著高于TP。综上所述，利用ISP制备分离蛋白可显著提高蛋白回收率，且分离蛋白的消化性明显优于TP。由于分离蛋白失去凝胶化能力，故可考虑将其应用于食品蛋白配料领域。  

利用坛紫菜藻红蛋白制备脯氨酰内肽酶抑制肽

以坛紫菜（Porphyra haitanensis）为原料，通过硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等方法分离纯化得到一种高纯度藻红蛋白（R-phycoerythrin，R-PE）（A565 nm/A280 nm=5.4）。利用胃、肠液消化酶对R-PE进行酶解制备脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）抑制肽。酶解条件为：1）胃蛋白酶与R-PE比例0.5%（m/m），酶解时间30 min，pH 1.2，温度37 ℃；2）胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶质量比为1∶1的混合酶，其与R-PE比例0.25%（m/m），酶解时间30 min，pH 7.5，温度37 ℃。Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现，经两步酶解，R-PE被完全降解。采用凝胶过滤色谱法测得R-PE水解液中分子质量在3 kDa以下的小肽含量为86.06%。R-PE水解液对PEP抑制水平IC50为136.35 μg/mL。酶抑制动力学研究发现，R-PE水解液对PEP表现为可逆的非竞争性抑制作用，抑制常数Ki为14 μg/mL。本研究利用坛紫菜R-PE制备活性高的PEP抑制肽，将为坛紫菜深加工及高值化利用提供一定的理论参考。