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L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase,Asd)催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸,该研究对Acinetobacter radioresistens来源的Asd酶进行酶学性质解析,为工业生产L-丙氨酸提供参考。构建表达质粒pET28a-ArAsd,转化大肠杆菌E. coliBL21(DE3)实现ArAsd基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带His标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察重组菌底物、产物耐受的能力。结果表明,重组酶比酶活力为753 U/mg,其最适催化温度为55℃,最适反应pH为4. 5,在40～45℃、pH 6. 0～7. 0条件下较稳定,45℃处理3 h酶活力剩余70%左右,pH 7. 0处理12 h酶活力剩余90%左右。产物L-丙氨酸浓度超过500 mmol/L时重组菌细胞酶活力有明显降低,底物L-天冬氨酸对重组菌细胞催化活性有促进作用。该研究首次在E. coli中异源表达Acinetobacter radioresistens来源Asd酶,其比酶活力高于目前已有报道的Asd酶,具有一定的工业应用潜力。 相似文献
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腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4. 2. 1. 84)是一种金属酶,能将腈类物质催化水合生成酰胺类物质,在工业上主要应用于烟酰胺和丙烯酰胺的生产。腈水合酶在应用过程中,普遍存在热稳定性较差的缺陷,而腈类的水合催化属于放热反应,在工业催化过程中,过高的反应温度使得腈水合酶的催化效率、重复利用率均较低,故寻找一种耐热型腈水合酶对工业应用以及理论研究具有重要意义。该研究以提高腈水合酶热稳定性为出发点,从美国国立生物技术信息中心通过BLAST筛选到一种新型耐热腈水合酶,该腈水合酶来源为温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1),该菌株最适生长温度为65～70℃。将来源于Cal. thermarum TA2. A1的腈水合酶基因序列进行密码子优化,基因合成后在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中异源表达,通过在该腈水合酶β亚基的C端添加strep标签成功纯化该酶,测定其在65℃的半衰期为3 h,在30℃下催化烟腈的比酶活为395 U/mg,其全细胞催化反应速率比已报道数据将近快1倍,烟酰胺的最终产量提高了25%,更有... 相似文献
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重组Escherichia coli细胞催化马来酸合成富马酸时,细胞中富马酸酶将产物富马酸转化成苹果酸,转化率达15.5%,降低了富马酸的转化率和纯度。将E.coli BL21(DE3)基因组中fum A-fum C基因敲除,并高效表达马来酸顺反异构酶,重组菌BL21(DE3)△fum A-fum C/p ET24a-mai A经发酵罐培养,可产生64 g/L菌体,马来酸顺反异构酶表达量达306 U/m L。按照60 g/L的发酵液:2 mol/L富马酸为1∶4的体积比配置反应液,37℃反应1 h,富马酸转化率高达98.4%,仅产生0.7%的苹果酸副产物。该结果为全细胞催化法合成富马酸的工业化奠定了基础。 相似文献
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以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的基因组为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽、成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-nk),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因(pro-nk),构建了含有三种不同信号肽的纳豆激酶重组质粒pMA0911-wapA-pro-nk、pMA0911-yncM-pro-nk、pMA0911-pre-pro-nk(m)。通过3种信号肽介导的纳豆激酶的分泌表达、酶活性质分析等实验结果表明,wapA信号肽介导的纳豆激酶的分泌效率以及纤溶酶活性最高。对wapA信号肽介导的纳豆激酶表达产物进行了纯化,纯化倍数及回收率分别为2.15和21.5%。酶学性质分析结果表明重组纳豆激酶的最适温度、最适pH分别为50℃和pH 8.0,纳豆激酶在温度低于60℃及pH 5.0~11.0比较稳定。本研究为纳豆激酶的基因工程改造以及进一步提高纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达量奠定了一定的基础。 相似文献
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从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。 相似文献
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血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一,因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶因其特有的高效溶血栓作用,成为国内外科研热点之一。本研究针对目前纳豆激酶稳定性的问题,以纳豆激酶的晶体结构和序列比对为基础,通过定点突变构建组纳豆激酶突变体,对可能影响纳豆激酶热稳定性的氨基酸进行研究。在构建的5个突变体中,P14L、N76D两个突变体的热稳定性有明显提高,在65℃下的半衰期由20 min分别提高为30 min和50 min。同源建模和分子动力学研究结果表明,这两个氨基酸位点是通过不同机理对纳豆激酶催化活性以及热稳定性产生的重要作用。本研究可为纳豆激酶的基因工程改造以及其生产和应用提供理论基础和技术支持。 相似文献
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L-苹果酸在食品、医药、化工等领域被广泛应用。工业上以石油基原料为底物,通过化学法或酶法合成L-苹果酸。随着石油资源的日渐短缺,利用可再生资源以生物法合成L-苹果酸受到人们的重视。近年来应用代谢工程策略改造大肠杆菌、酵母菌等菌株,进行L-苹果酸的合成,具有一定应用前景。同时,应用合成代谢工程在体外构建代谢途径进行L-苹果酸合成,具有较高的理论价值。本文首先总结了L-苹果酸合成的代谢途径;其次对L-苹果酸合成的代谢工程策略进行了综述,包括强化L-苹果酸合成代谢途径、删除副产物合成途径、促进还原力再生,以期较为系统地阐述L-苹果酸代谢机制的研究现状;最后对L-苹果酸代谢工程的研究方向进行了展望。 相似文献
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为了建立新的D-苯丙氨酸生产工艺,对固定化苯丙氨酸解氨酶（PAL）拆分D,L-苯丙氨酸进行了研究。以介孔材料（MCM-41）为载体固定PAL,将其用于拆分消旋体D,L-苯丙氨酸制备高光学纯的D-苯丙氨酸。最佳的固定化条件是载酶量为50mg/g、壳聚糖浓度为0.1%（w/v）、戊二醛浓度为0.05%（v/v）,固定化酶的活性达到最大,酶活保留达到92%,重复利用20次后,活性仍能保持85%。将制备的固定化酶应用于D,L-苯丙氨酸的拆分,反应24h L-苯丙氨酸转化率达到98%,D-苯丙氨酸的ee值达到96%,且连续拆分10个批次后固定化酶对L-苯丙氨酸的转化率仍保持在95%以上。因此,高效稳定的固定化PAL在拆分D,L-苯丙氨酸生产D-苯丙氨酸中具有良好的应用前景。 相似文献
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搅拌是影响发酵过程的主要因素之一,组合不同类型搅拌桨、发挥其各自优势,势必能够优化搅拌性能、提高微生物发酵生产效率。本研究采用计算流体力学（CFD）方法,模拟六直叶涡轮桨（DT）和DT、DT和抛物线桨（BT6）、六斜叶桨（CM6）和DT以及CM6和BT6四种搅拌桨组合对流场和混合时间的影响。对模拟得到的混合时间进行实验验证。结果表明,最优组合为：上桨叶为CM6桨,下桨叶为BT6桨。吸水链霉菌WSH03-13产谷氨酰胺转胺酶（TG）的发酵实验结果表明：CM6和BT6桨组合可获得最高的谷氨酰胺转胺酶活性和生物量,分别为4.7U/mL和42.9g/L,较优化前（DT和DT桨）分别提高了53%和40.9%,说明优化后的搅拌桨组合更有利于微生物生长和发酵。研究结果为组合搅拌桨在微生物发酵过程中的应用提供了借鉴。 相似文献
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