C4ST-1在大肠杆菌中的可溶性表达

软骨素-4-O-硫酸转移酶-1 (Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1,C4ST-1,EC 2.8.2.5)催化软骨素N-乙酰半乳糖胺(N-Acetylgalactosamine,GalNAc)4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)。C4ST-1含3对二硫键,在Escherichia coli细胞质内二硫键难以正确形成,故在E. coli中表达时主要以包涵体形式存在。为提高胞内可溶性蛋白质的表达水平,共表达了催化二硫键从头形成的巯基氧化酶(Erv1p)或/和促进二硫键正确折叠的二硫键异构酶(DsbC)。结果表明共表达DsbC可使C4ST-1融合蛋白的胞内可溶性表达水平显著提高,但C4ST-1和Erv1p共表达对胞内可溶性蛋白质的表达影响相对较小。C4ST-1和Erv1p或C4ST-1和DsbC共表达菌株的酶活分别为原始菌株的1.30和2.33倍,活力达到(12.32±0.76) U/L和(21.99±0.42) U/L。挑取同时共表达C4ST-1、Erv1p和DsbC的菌株进行摇瓶水平和3 L发酵罐放大培养,酶活分别达到(29.12±0.66) U/L和49.97 U/L。本研究为C4ST-1的大规模应用奠定了一定的基础。     

荚膜红细菌来源的酪氨酸酚裂解酶的酶学性质

L-酪氨酸作为人体非必需氨基酸之一,是合成苯丙素类化合物等多种高价值化学产品的重要前体物质。因其可作为营养补充剂,以及多肽类激素、抗生素、L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸等产品的原料,被广泛应用于食品、化工、饲料和医药等行业。为了促进L-酪氨酸的高效生产,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达来源于荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase,TPL),并进行了诱导条件优化、酶活测定和酶学性质分析。结果表明,来源于荚膜红细菌的TPL最适pH为8.5;最适温度为40℃;酶活和比酶活分别为0.29 U/m L和0.29 U/mg;体外全细胞催化的酶活为0.41 U/g;反应10 h生成L-酪氨酸产量为0.30 g/L。结果表明,来源于R.capsulatus的TPL在大肠杆菌中成功表达,为后续提高表达量及分子改造提高催化性能的研究奠定基础。     

人造肉生产技术相关专利分析

对近年来国内外关于人造肉生产技术相关的专利申请状况进行了分析,通过对历年专利申请趋势、主要申请人和发明人、专利布局情况的统计和对重点专利技术内容的解析,力求能全面系统地反映包括植物蛋白肉和细胞培养肉生产技术、人造肉商品化技术、人造肉重塑成型技术领域专利技术的发展及现状,寻找相关专利技术在发展中还存在的问题,并针对这些问题提出了下一步的研究方向,以期对尽早实现我国人造肉的规模化生产提供参考。     

产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株的构建

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是一种天然存在的非蛋白质类氨基酸,在医学和农业领域应用广泛。为构建生产ALA的酿酒酵母细胞工厂,作者首先在酿酒酵母中分别表达了来源于酿酒酵母和类球红细菌中编码ALA生物合成C4途径ALA合酶的hem1和hemA基因,同时又表达了来源于大肠杆菌编码C5途径关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基因hemA和hemL。结果表明,表达酿酒酵母自身来源的hem1基因更利于ALA的合成,ALA产量为327.6 mg/L。在此基础上将C4和C5途径的基因hem1、hemA和hemL在酿酒酵母中过量表达,在添加前体物质甘氨酸和琥珀酸的条件下,ALA产量为525.8 mg/L,实现了在酿酒酵母中合成ALA。     

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。     

摇床T25细胞培养瓶流体力学与传质特性研究

细胞培养技术是生物医药产业的支柱,以实现微小体积内的高密度、高通量细胞培养为目的,系统地研究了常用于单层静态培养的T25方瓶置于翘板摇床上在不同操作条件下的流体力学特性和传质性能。结果表明,振荡可以显著提高方瓶的传质速率并降低混合时间,使高密度培养成为可能,但瓶盖上的空气滤膜在高转速时成为传质速率的限制因素;培养瓶对称轴与摇床旋转轴平行时,其相对位置对混合和传质无明显影响,但当二者成45°角时,相同转速下混合时间显著缩短;使用自定义函数实现了基于动态网格的CFD模拟,对不同转速下方瓶内剪切应力和能量耗散在时间与空间上分布进行了分析,为基于T25培养瓶开发一次性高通量微型反应器提供了数据支持和理论基础。     

底物浓度对多级逆流工艺厌氧发酵城市污泥产酸的影响

考察了不同底物浓度对一种新型的厌氧发酵工艺--多级逆流工艺厌氧发酵城市污泥产酸效果的影响.结果表明,不同污泥底物质量浓度条件多级逆流厌氧发酵产酸效果变化较大,当污泥底物质量浓度为VS=100 g/L时,有机酸质量浓度与产率分别达到20 g/L 和0.20 g/gVS.对高浓度难降解污泥的处理,多级逆流工艺有较大优势.研究结果还表明,多级逆流促进了高质量浓度污泥底物发酵产酸的机制在于降低了发酵产物对厌氧产酸细菌的抑制效应.     

酿酒酵母中基于外壳蛋白复合物Ⅱ囊泡的蛋白分泌调控机制的研究进展

在酿酒酵母中,外壳蛋白复合物Ⅱ(COPⅡ)包裹的囊泡是蛋白质从内质网转运至高尔基体的媒介,其中COPⅡ囊泡介导的运输是蛋白分泌途径中至关重要的一步.COPⅡ囊泡的运输包括囊泡形成、出芽、束缚和融合.整个过程需要外壳蛋白亚基、三磷酸鸟苷(GTP)、束缚因子等多种组分的参与,且部分组分之间存在的相互作用确保了蛋白质的正确运输.研究对COPⅡ囊泡整个运输过程中受到的外壳亚基组装、蛋白质捕获以及膜融合等一系列调控机制进行较系统综述,有望为改造酿酒酵母中蛋白分泌途径提供参考.     

粉煤灰固定化细胞去除聚乙烯醇的研究

前期研究分离到一株能高效降解并矿化聚乙烯醇(PVA)的黄单胞菌(Xanthomonas sp.)。考察了利用改性处理或未处理粉煤灰吸附该菌株去除PVA的特性。结果表明,实验所采用的5种粉煤灰对该菌细胞等温吸附方程与Langmuir方程、Freundlich方程的拟合都达到很高的水平。改性粉煤灰对菌体细胞的吸附量由大到小的顺序为HC l处理粉煤灰>H2SO4处理粉煤灰>Ca(OH)2处理粉煤灰>NaOH处理粉煤灰>未处理粉煤灰。在培养初期,粉煤灰固定化细胞对PVA的去除量略低于等量游离细胞,但其去除速率的变化与游离细胞基本相同。