PCR-RFLP方法检测和鉴别五种李斯特菌

目的 建立快速检测和鉴别单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌等常见李斯特菌的方法。方法 采用PCR-RFLP技术,首先通过引物“Lis1A-Lis1B”对李斯特菌属iap基因进行扩增,扩增产物大小约1.4 kb,然后用限制性内切酶DdeⅠ对PCR产物进行酶切,电泳观察具有种间特异性的酶切谱带进行鉴别。结果 上述5种李斯特菌的PCR扩增产物经内切酶DdeⅠ消化后,得到片段大小不同的,具有种间差异的特异性酶切图谱。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可以用于上述5种常见李斯特菌的快速检测和鉴定。     

MALDI-TOF-MS方法检测、鉴定副溶血性弧菌

目的 应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立快速检测和鉴定副溶血性弧菌的方法。方法 采用副溶血性弧菌标准菌株,在不同的培养基或不同的培养时间进行MALDI-TOF-MS检测,同时对长时间冷冻保存的菌株进行检测,以验证该方法的稳定性和重复性。对不同来源的菌株进行检测,以确认方法的准确性。结果 用PW、TCBS琼脂和弧菌显色培养基等3种培养基,以及分别培养18 h、42 h和72 h的细菌,对该菌的蛋白质谱图影响很小;保存2年的菌株,其MALDI-TOF-MS鉴定分值保持稳定;对来自不同国家和地区的不同来源的菌株都可以得到同样准确的结果。结论 MALDI-TOF-MS方法可以快速、准确地鉴定副溶血性弧菌。因其具有很好的稳定性和重复性,可用于副溶血性弧菌的日常检测。     

实时荧光定量RT-PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病

用TaqMan探针技术设计探针和引物,建立了检测石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的实时荧光定量RT-PCR方法.对影响PCR反应的主要因素Mg2 浓度和退火温度进行了优化,表明当Mg2 浓度为3.0～3.5 mM,退火温度为58～59℃时可获得最佳的扩增和检测效果.应用鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)NNV主衣壳蛋白基因组片段构建的噬菌体假病毒作为阳性质控品,具有很好的稳定性.鞍带石斑鱼NNV的检测试验表明,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法是检测石斑鱼神经坏死病毒的一种快速、灵敏、准确的检测方法.     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在李斯特菌检测和鉴定中的应用

为建立食品中各种李斯特菌的快速检测和鉴定方法,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5种李斯特菌进行检测,并与传统的生化鉴定方法(VITEK 2)和聚合酶链式反应(PCR)方法检测结果进行比较;用不同培养基和不同培养时间培养的单增李斯特菌对该方法进行检测,还对60份人工感染5种李斯特菌的食品样品分别进行MALDI-TOF-MS、PCR以及传统生化方法的检测和鉴定。结果表明:MALDI-TOF-MS能够快速、可靠地区分上述5种李斯特菌,而且具有很好的稳定性和重复性,在检测时间、重复性和准确性方面的总体表现优于传统生化鉴定方法。MALDI-TOF-MS技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。