Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine~(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较

目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。     

靶向YB-1的microRNA表达载体的构建及其对MB-MDA-231细胞增殖的影响

目的：构建靶向YB-1基因的microRNA表达载体,研究其对乳腺癌细胞MB-MDA231增殖的影响。方法：采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的micro RNA,构建其过表达载体,利用Lipofectamine2000转染细胞MB-MDA231,荧光显微镜下评估转染效果,real-time ...     

实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA方法的建立及初步应用

目的:建立实时荧光定量PCR检测长链非编码RNA HULC的方法,探讨其在作为肝癌标志的应用价值.方法:根据Genebank中的HULC lncRNA(AY914050.1)全序列,设计HULC基因的特异引物,构建HULC基因的T克隆载体,命名为pMD18-T-HULC;以pMD18-T-HULC为实时荧光定量PCR检测HULC的标准品,建立实时荧光定量PCR检测HULC的方法并进行方法学评价.应用此方法检测8种肿瘤细胞株、肝癌组织、其它癌及癌旁组织中HULC lncRNA的表达.结果:HULC实时荧光定量PCR检测方法学的最低检测限为1.8× 103拷贝/L,线性范围为1.8× 103拷贝/L至4.6× 109拷贝/L;该法的批内变异系数(CV)＜2.0％,批间CV＜ 8.0％.其在肝癌组织和肝癌细胞株起始表达量为(7.6±3.1)×105拷贝/L至(5.6±3.2)×106拷贝/L,明显高于其它癌和癌旁组织HULC lncRNA表达量(＜1.8×103拷贝/L).新发现膀胱癌细胞株T24中表达量高[(6.7±2.4)×105拷贝/L],但在膀胱癌组织中表达低(＜1.8×103拷贝/L).结论:成功建立了实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA的方法,HULC lcRNA可望作为肝癌的标志.     

shRNA靶向干扰COX-2促进人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡

目的：探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡的促进作用。方法：重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,成瘤4周后处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线,RT-PCR和Western blot检测肿瘤组...     

环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经PmeⅠ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经PacⅠ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度。RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml。重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均<0.05)。结论成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础。     

人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的：构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法：将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进-步真空冷冻于燥,制备YB...