基于氧化石墨烯/聚吡咯-铟锡氧化物微电极的细胞阻抗生物传感器构建及细胞粘附增殖行为检测

构建一种基于氧化石墨烯/聚吡咯-铟锡氧化物GO/PPy-ITO（Graphene Oxide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide）微电极的细胞阻抗生物传感器并用于细胞粘附增殖行为学检测。ITO微电极采用光刻技术对感光干膜绝缘层蚀刻而成,通过一步法电聚合技术在ITO微电极表面沉积GO/PPy纳米复合膜制备GO/PPy-ITO微电极;形状测量激光显微镜和扫描电子显微镜分别对GO/PPy表面粗糙度和拓扑形貌进行表征;电化学循环伏安法及阻抗谱表征GO/PPy-ITO微电极的电化学性质;人肺癌细胞株A549粘附、铺展和增殖实验考察GO/PPy界面的生物相容性;以GO/PPy-ITO微电极作为传感电极,利用电化学阻抗谱技术对A549细胞的粘附增殖行为进行检测。结果显示,ITO微电极表面上电沉积的GO/PPy纳米复合物表面平整,分布大量的微孔结构;电化————————————学实验结果显示GO/PPy-ITO微电极比裸ITO微电极具有更低的阻抗特征和更高的电化学活性;GO/PPy比纯PPy膜更能促进A549细胞粘附、铺展和增殖;GO/PPy-ITO微电极表面A549细胞的粘附增殖行为改变电极系统的阻抗谱特征,通过对阻抗谱数据进行等效电路拟合分析获得细胞粘附增殖行为学信息。本文发展的GO/PPy-ITO微电极兼具优良的电化学性质和细胞生物相容性,基于该电极系统构建的细胞阻抗生物传感器可用于细胞病理生理学行为、药物筛选等研究领域。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

PML(NLS~-)干扰对HL-60细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨缺失核定位信号的PML,即PML(NLS-)干扰对急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响。方法将靶向PML(NLS-)基因的3组干扰质粒pGpu6-PML(NLS-)shRNA和阴性对照质粒pGpu6-NCshRNA分别转染HL-60细胞,转染后48 h,G418筛选阳性克隆,分别命名为Si-1、Si-2、Si-3和NC组,并设空白对照组。采用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分析细胞的细胞周期及凋亡情况。结果 Si-1和Si-2组HL-60细胞PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平与空白对照组相比明显减低(P<0.05),有干扰效果;Si-1组HL-60细胞的增殖水平与空白对照组相比明显降低(P<0.05),以转染后48 h降低最为显著(P<0.01);抑制PML(NLS-)表达可引起HL-60细胞S期比例增高,G1和G2期比例下降(P<0.05);Si-1组细胞凋亡率明显高于NC组和空白对照组(P<0.05)。结论干扰PML(NLS-)的表达可促进HL-60细胞的凋亡,抑制其增殖。     

GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响

目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升(P<0.01)。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。     

一种基于感光干膜-铟锡氧化物电极的简易细胞阻抗传感器实现细胞形态学和阻抗信息同时检测

加工一种基于感光干膜-铟锡氧化物DFP-ITO( Dry Film Photoresist-Indium Tin Oxide)电极的细胞阻抗生物传感器并实现细胞形态学和阻抗信息同时检测。35μm厚的感光干膜层压在ITO导电玻璃表面上作为绝缘层,通过照相制版技术在感光干膜绝缘层上蚀刻不同直径圆孔;以DFP-ITO作为工作电极,通过夹具和测量小池与Ag/AgCl参比电极、Pt丝对电极相连构成三电极阻抗测量系统;考察了不同直径DFP-ITO工作电极阻抗谱特征;通过细胞粘附实验及细胞毒性实验考察了感光干膜细胞生物相容性;通过光学显微镜和阻抗谱技术分别对接种在DFP-ITO电极上人肺癌细胞株A549粘附、增殖过程中的形
　　态学和阻抗信息进行检测和分析。研究结果发现不同直径DFP-ITO电极具有相似的阻抗特性;充分固化的感光干膜表面适宜A549细胞粘附且无明显的细胞毒性;基于DFP-ITO电极构建的细胞阻抗传感器能够通过光学显微镜获取A549细胞形态学数据,同时通过阻抗谱技术能够解析A549细胞粘附、增殖过程中的细胞质膜电容、细胞-细胞间隙电阻、细胞-ITO电极间隙电阻变化。本文发展了基于DEP-ITO电极的细胞阻抗传感器结构简单,可实现细胞形态学和阻抗信息的双通道获取,未来可用于细胞生理病理学行为和药物细胞毒性研究。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

NLS-RARα基因沉默对HL-60细胞增殖及分化的影响

目的探讨抑制NLS-RARα基因表达对急性早幼粒细胞白血病(Acute promyeolic leukemia,APL)细胞株HL-60增殖及分化的影响。方法将针对NLS-RARα基因的shRNA真核表达质粒(干扰组)和阴性对照质粒(阴性对照组)采用脂质体法转染HL-60细胞,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染的细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活力;RT-PCR和QRT-PCR法检测细胞中NLS-RARα基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中NLS-RARα蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达及细胞周期的分布。结果与阴性对照组和未转染组比较,干扰组HL-60细胞的增殖活力、NLS-RARα基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显下降(P<0.05);CD11b的表达明显升高(P<0.05);G1、G2期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少(P<0.05)。结论抑制NLS-RARα基因的表达可抑制HL-60细胞增殖,促进其分化。本实验为进一步研究APL发生发展的机制及APL的分子诊断和靶向治疗新途径奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。     

一种圆形横截面PDMS微血管模型的构建

基于软刻工艺发展的微血管模型为体外研究微循环系统疾病病理生理学机制提供了新思路,然而标准的软刻工艺加工的微通道呈矩形截面,不能真实地反映体内微血管管腔的圆形截面特征.本文介绍了一种简易的构建具有圆形截面特征聚二甲基硅氧烷(PDMS)微血管模型的方法.该方法以圆形截面微不锈钢丝作为模具,采用"微丝模塑抽除"软刻技术加工出具有圆形截面特征的微通道;优化微通道内细胞外基质蛋白修饰,并在修饰后的通道内进行血管内皮细胞EA.hy926灌流式培养.结果发现:纤维连接蛋白具有最佳的促进细胞黏附的效果,细胞在培养96 h后开始融合,细胞沿微通道内壁生长,保持生物活性且能承受高达2.5×10-4N/cm2的流体剪切力.本文介绍的圆形截面PDMS微血管模型加工的方法具有快速、简易的优点,可用于微循环疾病病理生理学机制的体外研究.