赭曲霉毒素A人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide NHS)法将赭曲霉毒素A(OTA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原OTA-BSA,采用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将赭曲霉毒素A(OTA)与卵清白蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果初步表明偶联成功。用OTA-BSA分10μg/只和50μg/只两个剂量分别免疫BALB/C小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗血清,效价可达1∶104,抑制效价达14.7ng,证明偶联成功,并显示低剂量免疫可以提高小鼠pAb的敏感性。本研究为OTA单抗的制备及其免疫学分析方法的建立奠定了基础。     

大菱鲆疾病早期快速检测方法——胶体金免疫层析试纸的研制与建立

使用成分单一的牛血清白蛋白(BSA)为模拟病原,以胶体金标记兔抗血清(即大菱鲆免疫球蛋白多抗)作为检测示踪物,并分别将BSA和葡萄球菌A蛋白印记到硝酸纤维素膜上制成检测线和对照线,通过一系列工艺创制与组装配套,首次成功制备了一套完整的大菱鲆抗体快速检测试纸。采用大菱鲆抗BSA血清作为阳性样本,以健康大菱鲆血清作为阴性样本,用以检验试纸的性能,并与酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测结果相比较。结果表明:本试纸检测抗体的特异性与敏感性均很高,与ELISA方法相当,而且使用方便,不需专业技能和额外的试剂与辅助仪器设备,5 min内即可用裸眼获得观察结果,很适合于基层生产操作及户外调研使用。以该实验为基础建立起来的抗体检测试纸,亦可推广应用于其他病害抗体的检测,可为鱼类疾病早期发生提供简易、快捷和操作性强的诊断方法。     

环丙氨嗪完全抗原的合成及免疫原性鉴定

目的合成并鉴定环丙氨嗪(cyromazine,CA)人工抗原。方法采用碳二亚胺法(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)将环丙氨嗪与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联;采用紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry,UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和动物免疫对人工抗原进行鉴定。经过4次免疫,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价,间接竞争ELISA测定血清灵敏性。结果 UV法和SDS-PAGE法结果初步显示半抗原环丙氨嗪和载体蛋白偶联成功;小鼠血清效价均在1:6400以上,2号小鼠多抗血清半数抑制浓度IC_(50)为27.5 ng/mL。结论本研究成功合成了环丙氨嗪的人工抗原,为环丙氨嗪单克隆抗体制备奠定基础。     

大菱鲆免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体的制备与特性鉴定

应用细胞工程技术研制大菱鲆免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)的单克隆抗体并分析其免疫学特性。小鼠骨髓瘤细胞NS0与经IgM免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,经过反复有限稀释法克隆,筛选获得4株抗大菱鲆IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为B1D1、D5C2、E1B2和F4A1。经小鼠腹水扩大生产后,单抗效价为1∶1.024×106检测灵敏度为32 ng/mL。Western blot分析表明,获得的单抗与IgM重链区特异性结合。交叉结果显示,单抗与大菱鲆血清呈强阳性反应,与褐牙鲆、红鳍东方鲀、许氏平鲉、六线鱼、鲈鱼均呈微弱阳性反应,而与半滑舌鳎、鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鳙鱼的血清无交叉反应。本研究制备的大菱鲆IgM单克隆抗体效价高、灵敏度高、特异性强,适合用于大菱鲆免疫学相关研究和生产实际应用。     

磺胺喹恶啉人工抗原合成及鉴定

国内首次用重氮化法将磺胺喹恶啉(SQ)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA.紫外扫描法与SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定表明偶联成功,偶联比分别为10.1∶1、9.8∶1.将SQ-BSA免疫BALB/C小鼠,获得了高效价、敏感性好的抗SQ血清,表明ELISA方法鉴定偶联成功,为进一步制备抗SQ单抗奠定了基础.     

恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究

采用混合酸酐法将恩诺沙星(ENR)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(ENR-BSA)和包被抗原(ENR-OVA).将免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体(ENR pAb),应用ENR pAb研制ENR残留阻断ELISA快速检测方法,并对其灵敏度、半数抑制浓度IC50特异性、准确度进行测定.结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205 ng/mL,灵敏度1 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为11 ng/mL,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均<0.1%,鸡肉样的平均添加回收率分别为87.35%,平均变异系数均<10%.本检测方法具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合ENR残留快速检测的推广应用.