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食品安全(GRAS)菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径(General secretion pathway)和Tat分泌途径(Twin-arginine translocation pathway)。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径(non-classical protein secretion pathway)进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SPphoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。 相似文献
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微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。 相似文献
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宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇,具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮(ADD)为底物通过化学法合成,但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应,实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析,筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮,结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高,因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L-1、底物浓度为5.40 g·L-1条件下,经过两次补料,获得了3.66 g·L-1宝丹酮,比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。 相似文献
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L-天冬酰胺酶(L-asparaginase II,EC 3.5.1.1)可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸,减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成,因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注,但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性,对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变,并在Bacilus subtilis 168 中进行表达,提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%,突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%,突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴,提高了其在食品工业中的应用前景。 相似文献
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从理化性能、离子交换容量、静态和动态吸附性能等方面对国产快流速CM-琼脂糖弱酸性阳离子交换介质进行了综合考察和评价,并应用该介质进行了鸡蛋清中溶茵酶的分离.结果发现,国产介质的理化性能符合要求,离子交换容量达到了187 mmol/mL,高于国外商品介质;对模型蛋白溶菌酶的静态和动态吸附容量分别达到了107.0 mg/mL和90.3 mg/mL(高流速下),同样略高于国外商品介质,显示能够满足蛋白质的有效吸附;离子交换层析分离蛋清溶菌酶较为成功,纯度在95%以上,产量达到了4.1 mg/mL鸡蛋清. 相似文献
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从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20~35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。 相似文献
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为了在AgGaSe2 晶体中产生3次谐波,利用自行研制的1台可调谐脉冲CO2激光器,在2次谐波中采用Ⅰ类匹配,并在3次谐波中采用Ⅱ类匹配的方法。实验中CO2激光输出波长为9.6m,在AgGaSe2 晶体中得到了波长为4.8m的2次谐波以及波长为3.2m的3次谐波,其峰值功率分别为88kW和4kW,并测量了相位匹配允许角。结果表明,在该AgGaSe2晶体实验中能有效地输出3次谐波,随着CO2激光功率的增大,输出2次谐波峰值功率和3次谐波峰值功率的级数都增加。 相似文献