单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光SPIA方法的建立

以单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）hly A基因为靶序列,设计5’端为RNA序列,3’端为DNA序列的嵌合引物和链终止Blocker序列,经过优化,建立实时荧光单引物等温扩增（Real-time fluorescence SPIA）方法,进行特异性、检出限实验,并对不同DNA提取方法进行比较。结果显示,确定荧光染料SPIA法的最佳反应温度为58℃,反应30 min,引物特异性良好,只有4株不同来源的L.monocytogenes DNA产生典型的S型荧光扩增曲线。对L.monocytogenes纯培养DNA的检出限为3.6×10¹fg/μL,相应菌液浓度为1.2×10¹CFU/m L;Realtime fluorescence SPIA检测试剂盒法、水煮法、溶菌酶-蛋白酶K法、饱和酚提取法四种方法提取DNA,均产生典型的扩增曲线,Ct值没有明显差异。对人工添加猪肉火腿样品中的L.monocytogenes,采用水煮法提取DNA的检出限为1.1×10²CFU/g。结果表明,所建立的L.monocytogenes的Real-time fluorescence SPIA新型等温扩增方法,特异性强、灵敏度高、不受DNA纯度的影响、快速、简便。      

应用PCR快速检测食品中沙门氏杆菌方法的研究

本研究利用沙门氏杆菌属特异的inv A基因序列，设计一对特异性的引物，通过PCR反应来检测多种样品中的沙门氏杆菌；反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果显示：此PCR方法检测沙门氏菌属的特异性为100％：样品中活菌的检测限为1．43CFU／10g：反应的最佳退火温度是65℃；最适模板浓度范围在10^4～10^8copies／ml。本方法与传统的沙门氏杆菌检测方法以及最近报道的相关方法比较，具有简单、快速、特异性好和敏感性高、经济等特点，并可满足大批样品沙门氏杆菌筛选检测的要求。     

大豆、油菜籽及大豆油中外源基因检测的灵敏度、准确度研究

本研究针对转基因产品中转入的目的基因以及启动子、终止子,设计了相应引物35SCP142、CPNOS165.通过对引物的调整,使PCR扩增产物的大小控制在100～170 bp,从而提高了检测灵敏度.在25μl的PCR反应体系中,可以检测到0.01ng的外源DNA.为了检测以大豆为原料的油脂类产品中的外源基因,我们又设计了NEST-PCR的两对引物35SCP318和35SCP114,并检测到了外源基因的片断.对新设计的引物进行准确度分析,即在不同的样品(包括转基因或非转基因产品)中进行检测,并经测序验证,新设计的引物35SCP142,CPNOS165及NEST-PCR的引物都有高特异性,可用于含有相应外源基因的产品检测.     

啤酒污染菌快速检测鉴定技术的开发与应用

本研究针对啤酒酿造过程污染微生物传统培养技术检测时间长、结果严重滞后的现状,围绕提高检测效率、加强微生物监控能力而进行的基因芯片技术与快速培养技术的创新与开发。通过对啤酒有害菌、好氧菌＋肠道致病菌两种啤酒行业专用基因芯片的开发,达到了在6～8小时内完成96个样品的12种啤酒有害菌、3个属的好氧菌和3种肠道致病菌的同步检测和鉴定;通过采用v向应面试验设计方法对传统MRS培养基进行的优化、改良,将使啤酒有害菌的检测时间从原来的7天缩短到2天,解决了以往检测片球菌属所遇到的生长缓慢、菌落微小、甚至不生长的难题。将以上两种检测技术有机结合,为啤酒生产建立了一套经济、快速、高效、全面的微生物污染预防控制体系,避免了检测结果滞后带来的质量问题和经济损失。     

实时荧光定量PCR监测镇江香醋醋酸发酵过程中微生物变化

对镇江香醋醋酸发酵阶段醋醅中功能微生物的变化进行定量分析。建立了实时荧光定量PCR方法,对醋酸发酵阶段醋醅中总细菌、总真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母的动态变化进行了定量分析。研究结果表明,发酵起始阶段(1～7天)醋醅中总细菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量快速上升,分别于第6、7、4天达到最大值,为4.85×1011,1.14×1010和3.37×1011copies/g干醅。随后各类细菌的生物量逐渐下降,并维持在一定水平。醋醅中总真菌和酵母的生物量在发酵前期变化不大,7天后至发酵结束总真菌的生物量逐渐下降为7.59×104copies/g干醅,而酵母生物量则在发酵8～12天内下降为0。     

锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究

RAS突变的检测为指导结直肠癌的预测和预后提供了有力的工具。探讨一种简洁、低成本的用于检测KRAS基因突变的多重引物等位基因识别方法(multiplex primer allelic discrimination, MP_mAD)。利用不对称扩增和含锁定核酸(locked nucleic acid, LNA)的等位基因特异性引物、以及共同的反向引物和探针,进行多重孔检测和参考孔检测,以多重检测和参考检测的扩增循环数值差(ΔC_q)来判定结果。同时使用福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues, FFPET)样本或在野生型基因组DNA背景下混合质粒进行非临床性能评价,并采用Kappa检验比较MP_mAD与Sanger测序的结果一致性。该方法对KRAS热点突变检测灵敏度至少为3%;凝胶电泳也验证了方法的特异性;重现性的变异系数(coefficient of variation, CV)<15%;同源基因检测未观察到交叉反应。通过分析115例FFPET标本...     

大鼠血栓调节蛋白基因引物的设计与研究

设计了大鼠血栓调节蛋白基因PCR扩增引物,并对引物与模板的加入量及退火温度等进行了研究,优化了PCR反应.结果表明,PCR反应所得产物电泳条带清晰,位置正确,无非特异性扩增带;用该方法设计得到的基因引物能够高效、特异性地进行PCR反应.     

甘蓝型油菜SSR核心引物研究

为了确定一组适用于品种纯度鉴定和遗传多样性分析的SSR核心引物,以100份具有代表性的甘蓝型油菜品种（系）为研究材料对746对SSR引物进行筛选,综合考虑PIC（平均多态信息量）值大小、引物重复性、扩增带型清晰度、连锁群分布等因素,确定44对引物为甘蓝型油菜核心引物,其中20对引物为首选核心引物,24对引物为备选核心引物。20对首选核心引物每对可检测到3~9个多态性位点,PIC值介于0.56~0.80,共检测到102个位点,分布于11个连锁群上。随机抽取1对核心引物对一个杂交组合大田制种F1纯度进行鉴定,其鉴定结果与田间自然鉴定结果一致,并可同时鉴别出来源于父本及外来的混杂单株。将44对核心引物应用于品种的系谱分析和100份品种遗传多样性聚类分析,同样得到了很好的验证结果。该套SSR核心引物适用于甘蓝型油菜品种鉴定及遗传多样性研究。     

美食成为加拿大人到中国旅游的主要吸引物

不久前，中国国家旅游局驻多伦多办事处通过加拿大全国性日报《环球邮报》在加拿大公民中进行了“中国旅游吸引力”有奖问卷调查，调查结果近日揭晓，根据收到的3000多份有效问卷结果显示。这些受访者无论是否有计划到中国旅游，长城、北京故宫、中国美食都在“中国十大旅游吸引物”排名中位列前三名。     

实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp A基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp A基因。