| 摘 要： | 目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因编码区磷酸化位点的真核突变载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中进行表达。方法利用定点诱变技术将GRP78基因的两个磷酸化位点进行突变,即203位苏氨酸(T)用丙氨酸(A)替换,466位酪氨酸(Y)用苯丙氨酸(F)替换,以质粒pEGFP-N1-GRP78为模板,进行PCR扩增后,构建突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F),并进行DNA测序分析。将测序正确的突变质粒转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot法检测融合蛋白在细胞中的表达。结果突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F)经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;突变质粒组荧光蛋白表达分布于细胞质内,细胞核内无表达产物分布;3个突变质粒转染组在相对分子质量约105 000处均可见目的蛋白条带,大小与预期相符。结论成功构建了人GRP78单突变T203A、Y466F和双突变T203A/Y466F真核表达载体,并可在肝癌SMMC-7721细胞中表达,为进一步研究GRP78基因磷酸化位点T203、Y466在肝肿瘤侵袭和转移中的作用奠定了基础。
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