壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因，命名为BUT，该壳聚糖酶基因大小为903 bp，编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现，该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46），与其它壳聚糖酶相似度为59%，是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成，与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT，转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主，进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化，SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa，DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究，结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0，在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用，SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现，BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。