| 摘 要： | 目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株。方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒)。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因m RNA转录及蛋白的表达水平。结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功。经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株。与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因m RNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P0.05)。结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。
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