| 摘 要： | 目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC~(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。
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