柱前衍生化液相色谱法测定牛血清中游离氨基酸含量

目的建立牛血清中18种游离氨基酸含量的柱前衍生化液相色谱测定方法,并进行验证。方法采用乙腈沉淀方法去除血清样品中的蛋白,以异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate,PITC)在三乙胺碱性条件下衍生游离氨基酸,采用氨基酸分析柱(Sepax AAA,250 mm×4.6 mm ID)及乙腈-醋酸钠缓冲体系梯度洗脱分离18种目标组分,紫外检测器波长为254 nm。对建立的方法进行重现性、准确性和精密性验证,并确定方法的线性范围及检测限。结果18种游离氨基酸在60 min内完成分离,各目标组分在0.5~2.5μmol/L浓度范围内呈良好的线性关系,方法检测限在0.019~0.163μmol/L之间,相对标准偏差(RSD)在0.42%~2.28%之间。准确性和精密性试验中检测各组分的平均回收率在93.10%~101.61%之间,RSD在0.19%~3.82%之间。结论采用PITC柱前衍生化液相色谱法可实现牛血清中18种游离氨基酸的含量测定,该方法简便易行,重现性、准确性及精密性良好,可为动物营养及生理研究提供检测手段。