酸冷胁迫下保加利亚乳杆菌定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点，被广泛应用于目的基因表达的定量分析，而筛选表达水平稳定的内参基因是提高qRT-PCR结果准确性的重要前提。保加利亚乳杆菌既是酸奶发酵剂的常用菌种，又是引起酸奶后酸化的主要菌种。为了筛选保加利亚乳杆菌后酸化相关功能基因表达分析的qRT-PCR内参基因，以保加利亚乳杆菌的模式菌株ATCC 11842为试验菌株，根据前期ATCC11842菌株在后酸化不同条件下转录组学测序结果，选择5个候选内参基因（16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA），通过qRT-PCR技术研究候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下的表达量水平，即Ct值变化。采用3款软件geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析比较候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的表达稳定性，并筛选获得qRT-PCR的最适内参基因。运用筛选到的最适内参基因，分析ATCC 11842菌株的3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量，验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明：同一候选内参基因Ct值在酸胁迫和酸冷胁迫下，rpoB和recA表达量变化最小。比较3个软件分析结果，一致得出：rpoB和recA是在酸胁迫和酸冷胁迫下表达最稳定的2个基因，即筛选出的qRT-PCR最适内参基因为rpoB和recA；3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量的分析结果与前期转录组学测序结果一致，进一步证实本研究筛选的2个内参基因rpoB和recA的可靠性。本文为利用qRT-PCR技术研究保加利亚乳杆菌后酸化功能基因表达以及揭示后酸化机制及定向选育弱后酸化菌株提供了依据；也为采用qRT-PCR技术研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同条件下功能基因表达提供借鉴。

Screening of Internal Reference Genes for Quantitative PCR of Lactobacillus bulgaricus under Acid and Cold Stress