Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性

为改良米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr~(13)(Y13)置换为Phe(F)。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A~(Y13F);以重组质粒p PIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因(Aoxyn11A~(Y13F));分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A~(Y13F)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A~(Y13F)的耐热性进行了分析。结果表明:突变酶的最适温度T_(opt)由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A~(Y13F)在50℃的半衰期t_(1/2)~(50)为95 min,较AoXyn11A(t_(1/2)~(50)=6 min)延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。     

利用N-糖基化修饰对β-甘露聚糖酶Man47的稳定性改造

N-糖基化是真核生物蛋白质最重要的翻译后修饰之一。以Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶Man47为研究对象,利用计算化学对A.tabescensβ-甘露聚糖酶Man47进行理性设计,经过分子对接、二级结构分析和糖基化的可行性分析后,构建具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列的突变体g-123作为N-糖基化的突变位点。将其整合到毕赤酵母表达载体SMD1168上,通过电转化得到重组转化子。最后对突变体g-123的温度稳定性、酸碱稳定性、胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性进行分析。结果表明:糖基化A.tabescensβ-甘露聚糖酶Man47突变体g-123与野生型相比,其热稳定性、酸碱稳定性、蛋白酶抗性均得到不同程度的改善。     

T26P和A30P位点突变对Thermobifida fusca葡萄糖异构酶热稳定性及活性的影响

通过定点突变技术构建了嗜热菌Thermobifida fusca葡萄糖异构酶(TFGI)的3个突变体:TFGI/T26P,TFGI/A30P和TFGI/T26P/A30P。结果表明突变体TFGI/A30P的热稳定性得到提高,70℃下半衰期从14.9h提高到22.3h,且最适温度不变,最适温度下的比酶活保持不变。而突变体TFGI/T26P和TFGI/T26P/A30P在70℃下半衰期都降到8.1h,最适温度和最适温度下的比酶活也都显著降低。TFGI及其单突变体的三维结构模型叠加分析结果表明:突变体A30P没有产生其它分子间作用力,TFGI的"Phe27环"的基本结构没有改变,因脯氨酸残基降低了蛋白解折叠的熵值,所以其热稳定性提高而比活力不变。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

黄瓜花叶病毒2b蛋白C末端无抑制局部RNA沉默的活性

目的:黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的2b蛋白具有RNA沉默抑制子的功能,其C末端氨基酸序列非常保守。为了明确2b蛋白C末端保守序列在RNA沉默抑制中的作用,构建了CMV Q株系野生型2b及其C末端缺失突变体2bdelC的植物瞬时表达载体。通过农杆菌共渗滤法对野生型2b及其C末端突变体的沉默抑制子活性进行了分析。结果与结论:烟草接种叶片中野生型2b及其C末端突变体的Western blot检测表明,野生型2b蛋白与其C末端突变体在植物中积累水平变化不大,说明2b蛋白C末端氨基酸残基在维持2b蛋白在植物细胞中的稳定性方面无作用。在整株、细胞和分子水平上分别比较了野生型2b及其突变体2bdelC对共表达GFP的表达量影响,结果表明在所有的测定结果中二者均无明显地差异,说明2b蛋白C末端94-111位氨基酸在抑制局部RNA沉默上无生物学活性,讨论推测C末端应不存在与小RNA结合的结构域。     

S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

头孢菌素C酰化酶突变位点的研究

头孢菌素C酰化酶能直接将头孢菌素C(CPC)转化为7-氨基头孢烷酸(7-ACA),此一步酶法具有很大的经济价值,所以得到很多研究者的关注,特别是提高CPC酰化酶活性及专一性的研究。以CPC酰化酶基因ecs50为基础,利用重叠延伸PCR,对文献报道的活性提高的突变体酶S12的6个位点分别进行突变,将得到的6个突变体V122A、G140S、F297N、I314T、I415V、S710L进行诱导纯化后,检测酶活,以此来研究不同突变位点对酶活力的影响。结果 V122A的比活为106U/mg,它的转化效率比初始酶提高23.7%。     

脱钙对水泥浆体中C S H凝胶结构的影响

采用X射线荧光分析、X射线衍射、Fourier红外光谱、29Si固体核磁共振谱结合去卷积技术研究了脱钙对水泥（ASTMⅠ型）浆体中CSH凝胶结构的影响.结果表明：对于水化3,28d的水泥浆体,其脱钙过程均为2个阶段,即：当水泥浆体的钙硅比(摩尔比)由2.78左右降至2.00左右时,几乎全部游离的CH被脱去,CSH凝胶部分脱钙,浆体的脱钙主要在这个阶段完成,CSH平均链长分别由2.4,2.9增加至4.4,5.8,且I(Q2)/I(Q1)增加;当水泥浆体的钙硅比降至1.83左右时,CSH凝胶脱钙,并产生了更显著的聚合,CSH平均链长进一步分别增加至6.2,9.9,且I(Q2)/I(Q1)继续增加;Alite和Belite在整个脱钙过程中的变化并不明显.脱钙过程中CSH二聚体向更高聚合态转变,但是Al掺杂会影响CSH结构的稳定性.从分子尺度理解,脱钙如能使桥硅氧四面体结构稳定,对于CSH结构的优化是有利的     

白化牙鲆幼鱼与角叉菜和孔石莼混养的能量平衡和体色恢复率

将体重为(5.04±2.14)g、体长为(8.15±2.84)cm的白化牙鲆Paralichthys olivaceus幼鱼饲养在容积38 L、底面直径17 cm的白色塑料桶中,放养密度为15尾/桶。试验共设7组,分别放入密度为0(对照组)、1、2、3 g/L的孔石莼Ulva pertusavar和3、5、7 g/L的角叉菜Pelvetua siliquosa,每组设3个重复,自然光照。30 d的生长试验表明,牙鲆与石莼混养能改善水质,促进牙鲆体色恢复。第二个阶段的试验,白化牙鲆仅与石莼混养,放养密度为10尾/桶。试验共设4组,每组放入石莼的密度(湿重)分别为4、3、2、0 g/L,记为H、I、J、K组,每组设3个重复。测定牙鲆的能量收支和体色恢复率(即试验结束和开始时白化鱼有眼侧正常体色的面积分别占试验结束和开始时有眼侧总面积的百分比之差)。经60 d的饲养,各组鱼的能量平衡式如下:H组100C=8.99F+5.66U+29.60R+46.33G(平衡率为90.58%);I组100C=7.20F+6.28U+33.20R+41.52G(平衡率为88.20%);J组100C=7.53F+7.13U+35.60R+36.62G(平衡率为86.88%);K组(对照组)100C=8.40F+7.04U+44.90R+29.91G(平衡率为90.25%),其中H、I、J 3个试验组鱼的生长能占同化能的比例分别比对照组的增加了16.42%、11.61%和6.71%;体色恢复率也显著高于对照组(P<0.05),依次为I组>J组>H组>K组(对照组)。     

新颖微生物低温酯酶EstP8的酶学性质研究与在手性催化中的应用

从假单胞菌Pseudonocardia antitumoralis HUP007基因组中克隆了一个1 041bp的酯酶基因Est P8,编码的蛋白具有377个氨基酸残基。在E.coli BL21(DE3)中实现酯酶Est P8的高效异源表达和纯化。Est P8为脂肪酶家族Ⅳ中的一员,具有HGGG保守序列。Est P8最适底物为对硝基苯酚乙酸酯(p-NPO),最适温度和p H分别为50℃和8.0。Est P8催化p-NPO水解反应的活性、Vmax和Km分别达到105.19U/mg、89.4μM/min、1.144m M。Est P8在p H7.0~8.0范围内具有良好的p H稳定性;在4℃时,酯酶相对活力为41.78%,在10~40℃内具有很好温度稳定性。Est P8对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)对该酶的活性有激活作用。辛烷、庚烷、甲苯、丙酮、DMF等有机溶剂对Est P8的活性同样具有激活作用。酯酶Est P8还可以通过水解拆分高效地制备手性(R)-1-苯基乙醇;添加有机溶剂可以很好地促进该酯酶的光学选择性和产率,在共溶剂甲苯的存在下,所制备的(R)-1-苯基乙醇的e.e.和产率可达91%和18%;在共溶剂DMSO的存在下,所制备的(S)-乙酸苏合香酯的e.e.和产率可达98%和60%。酯酶Est P8在手性生物催化等诸多工业领域有很好的应用潜力。     

基坑涌水量计算

基坑开挖,当基坑底为一般碎石土、砂类土,并处于干河床时,其总涌水量Q(米~3/天)可按下式计算: Q=1.36KH~2/(1g(R+γ_0)-1gγ_0 (1)式中K——渗透系数(米/天); H——稳定水位至设计基坑底     

魁蚶加工副产物酶解工艺及酶解产物抗氧化效果研究

为高效开发利用魁蚶Scapharca broughtonii加工副产物,以水解度、氨基态氮含量和产物相对分子质量分布为指标,筛选了碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶5种蛋白酶,通过单因素和响应面试验,建立碱性蛋白酶最佳酶解工艺,并对最优工艺条件下酶解产物的抗氧化效果进行测定。结果表明:从氨基态氮含量和水解度的变化可知,碱性蛋白酶的酶解程度最高,其次为风味蛋白酶和酸性蛋白酶,中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果不佳;碱性蛋白酶酶解最佳参数条件为料液比(g∶mL)1∶4、pH 8.5、温度45℃、加酶量800 U/g、酶解时间3 h,在此条件下,水解度(DH)为35.74%;酶解产物具有明显的抗氧化效果,与十分之一用量的VC效果相当。研究表明,碱性蛋白酶是酶解魁蚶加工副产物获得较多小分子蛋白肽的良好用酶,本研究结果可为小肽型水产饲料开发提供基础数据。     

魁蚶加工副产物酶解工艺及酶解产物抗氧化效果研究

为高效开发利用魁蚶Scapharca broughtonii加工副产物,以水解度、氨基态氮含量和产物相对分子质量分布为指标,筛选了碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶5种蛋白酶,通过单因素和响应面试验,建立碱性蛋白酶最佳酶解工艺,并对最优工艺条件下酶解产物的抗氧化效果进行测定。结果表明:从氨基态氮含量和水解度的变化可知,碱性蛋白酶的酶解程度最高,其次为风味蛋白酶和酸性蛋白酶,中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果不佳;碱性蛋白酶酶解最佳参数条件为料液比(g∶mL)1∶4、pH 8.5、温度45℃、加酶量800 U/g、酶解时间3 h,在此条件下,水解度(DH)为35.74%;酶解产物具有明显的抗氧化效果,与十分之一用量的VC效果相当。研究表明,碱性蛋白酶是酶解魁蚶加工副产物获得较多小分子蛋白肽的良好用酶,本研究结果可为小肽型水产饲料开发提供基础数据。     

秀丽隐杆线虫作为Ras/MAPK信号通路的抗肿瘤药物筛选模型研究

目的采用秀丽隐杆线虫Ras/有丝分裂原蛋白活化酶(MAPK)信号通路上的过度激活系列突变体研究该模式生物作为Ras/MAPK信号通路的抗肿瘤药物筛选模型的可行性及其分子机制。方法采用96孔板将索拉菲尼和依托泊苷作用于L1期秀丽隐杆线虫(每孔80~100条),并设空白对照,每个处理设3个重复。培养秀丽隐杆线虫4~5 d后,于倒置生物显微镜下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目。与空白对照比较,野生型比例越高,说明药物效果越好。结果索拉菲尼能够剂量依赖性地逆转let-60/ras(gf)和mek/erk(gf)双突变体多阴门表型,对其下游转录因子lin-1(lf)和lin-31(gf)多阴门突变体几乎没有影响;依托泊苷对信号通路上游因子let-60/ras(gf)及下游转录因子突变体lin-31(gf)均有明显的抑制作用,不依赖细胞信号通路。结论秀丽隐杆线虫模型不但能够筛选靶向Ras/MAPK信号通路的抑制剂,还能评价肿瘤细胞毒药物。     

斑点叉尾鮰鱼肠蛋白酶的分离纯化及其酶学性质

以斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus鱼肠道为原料提取蛋白酶,对分离条件进行了优化,并对部分酶学性质进行了研究。结果表明:鱼肠内的蛋白酶在硫酸铵饱和度为70%时,所得沉淀中酶活力最高。经过阴离子交换层析分离后,蛋白酶的纯化倍数达到了218倍。该蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH为7.5,具有良好的低温稳定性和酸碱稳定性,米氏常数为5.4 g/L。K+和Ca2+离子对该蛋白酶活性有较弱的激活作用,Mg2+则能显著激活蛋白酶活性;Na+和Zn2+对蛋白酶的活性有较弱抑制作用,而Cu2+和EDTA能显著抑制蛋白酶活性。     

柠条锦鸡儿香豆酸-3-羟化酶基因克隆及其功能初步研究

香豆酸-3-羟化酶(Coumarate 3-Hydroxylase,C3H)是木质素生物合成途径中的关键酶之一。以柠条锦鸡儿为材料,利用RACE技术克隆了C3H基因。对柠条锦鸡儿C3H基因的gDNA和cDNA全长分析显示该基因具有3个外显子,2个内含子,编码框长度为1530bp,编码509个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点位7.67,分子量约57.61kDa。氨基酸序列分析显示具有一个保守的P450结构域。系统进化分析表明该蛋白与大豆C3H具有最高的同源性,将该基因命名为CkC3H,GeneBank登录号为HQ829858。构建了35S启动子驱动的CkC3H基因植物表达载体,互补拟南芥C3H(CYP98A3)基因突变体ref8,转基因植物表型得以部分恢复。这些结果说明柠条锦鸡儿CkC3H与拟南芥C3H至少具有部分相同的功能。     

B.cereus MBL13-U产牛骨胶原蛋白酶工艺优化

为了获得能够高效降解牛骨胶原蛋白的新型胶原蛋白酶,以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U)为出发菌种,以胶原蛋白酶活力为检测指标,对影响发酵的4个因素(菌种接种量、发酵温度、p H、发酵时间)进行单因素试验。通过四元二次正交旋转组合试验,确定了B.cereus MBL13-U菌株发酵制备胶原蛋白酶的最佳工艺。当菌种接种量4%(体积分数)、发酵温度35℃、初始p H6.4、发酵时间46 h时,胶原蛋白酶活力达(92.31±1.13)U/m L。将其作用于牛骨胶原蛋白,通过扫描电子显微镜对酶解过程中的牛骨胶原蛋白进行结构分析。分析结果表明:酶解破坏了牛骨胶原蛋白原本完整的表面结构,使其所含的Ⅰ型胶原蛋白更多地暴露在表面,加快水解。     

鲍鱼来源褐藻胶裂解酶菌株的筛选及发酵条件优化

为筛选得到高效产褐藻胶裂解酶(Alginate lyase)微生物菌株,实现其商业化应用,采用平板透明圈法从皱纹盘鲍Haliotis discus hannai肠道中筛选得到1株高效产胞外褐藻胶裂解酶的菌株SS-1,在扫描电子显微镜下观察菌株形态和平板菌落特征,并根据其16S rRNA基因序列分析结果,鉴定该菌株为弧菌Vibrio sp.SS-1。对SS-1菌株的发酵条件进行优化,结果显示,该菌株最适发酵温度为30℃,初始p H值为7.2,培养28 h后酶活力可达38.6 U/m L;通过响应面法优化最佳发酵培养基配方,结果为麦芽糖11.86g/L、酵母粉16.72 g/L、K2HPO41.36 g/L、Mg SO4·7H2O 1.5 g/L、Fe SO4·7H2O 0.1 g/L、Na Cl 6.75 g/L;在最佳培养条件下,酶活力可达191.8 U/m L,较优化前提高了4.97倍。研究表明:该菌株具有生长快速、酶活较高的特点,可为褐藻寡糖的制备提供技术积累。     

鲍鱼来源褐藻胶裂解酶菌株的筛选及发酵条件优化

为筛选得到高效产褐藻胶裂解酶(Alginate lyase)微生物菌株,实现其商业化应用,采用平板透明圈法从皱纹盘鲍Haliotis discus hannai肠道中筛选得到1株高效产胞外褐藻胶裂解酶的菌株SS-1,在扫描电子显微镜下观察菌株形态和平板菌落特征,并根据其16S rRNA基因序列分析结果,鉴定该菌株为弧菌Vibrio sp.SS-1。对SS-1菌株的发酵条件进行优化,结果显示,该菌株最适发酵温度为30℃,初始p H值为7.2,培养28 h后酶活力可达38.6 U/m L;通过响应面法优化最佳发酵培养基配方,结果为麦芽糖11.86g/L、酵母粉16.72 g/L、K2HPO41.36 g/L、Mg SO4·7H2O 1.5 g/L、Fe SO4·7H2O 0.1 g/L、Na Cl 6.75 g/L;在最佳培养条件下,酶活力可达191.8 U/m L,较优化前提高了4.97倍。研究表明:该菌株具有生长快速、酶活较高的特点,可为褐藻寡糖的制备提供技术积累。