产脂肪酶海洋嗜冷菌的鉴定及酶学性质研究

从东海的深海底泥中筛选出一株产脂肪酶的海洋细菌 EastSeaG5-1415,该菌为革兰氏阴性好氧菌,短杆状,0.9～1.3μm×1.5～3.8μm,无鞭毛,无芽孢,无色素,菌落光滑不透明,过氧化氢酶和氧化酶阳性,甲基红实验阴性,氧化葡萄糖产酸,可耐受10%的NaCl.此菌最适生长温度为18℃,最高生长温度为35℃,在0℃也能生长,是典型的嗜冷菌.菌株脂肪酸种类为C17:1(28.2%),C18:1 9c(49.7%),辅酶Q-8是其主要的异戊烯醌类,DNA中G C含量为45.2mol%.以16SrRNA同源性为基础构建了相关种属细菌在内的系统发育树,在系统发育树中,分离菌株 EastSeaG5-1415 与 Psychrobacter glacincola 在同一分支,二者的序列相似性为97.6%,DNA 杂交显示与 P.glacincola 最为相近,达到87%.结合形态和生理生化试验,将其鉴定为嗜冷杆菌 P.glacincola.同时对其所产脂肪酶的性质进行了初步研究.该菌所产碱性脂肪酶最适反应温度为35℃,在5℃时仍有较高酶活,酶活达到23%,最适 pH 值为9,属低温碱性脂肪酶.     

中国对虾部分基因组文库构建和微卫星DNA序列的筛选

以中国对虾为实验材料,提取肌肉的基因组DNA。经Bsp143Ⅰ酶切后,回收500～1000bp的DNA片段,与经BamHⅠ酶切并去磷酸化的PUC19重组,将重组载体转入大肠杆菌DH5α中。然后将其涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,过夜培养后,经蓝白斑筛选,构建对虾部分基因组文库。采用载体质粒的通用引物进行PCR检测插入片段的大小,对基因组文库进一步进行筛选。从建立的文库中选取100个片段大小合适的克隆进行测序,其中54个克隆的DNA插入片段含有微卫星序列,共获得了111个微卫星序列,在GenBank中注册了12个微卫星序列。本实验中还发现1个含有23bp的小卫星序列。     

TUB2基因重组质粒的构建、鉴定及其在毛壳菌中的转化

根据苯并咪唑类杀菌剂抗性基因的核酸序列 ,在其阅读框架外的上、下游设计一对特异性引物 ,并在其 5′ 端分别加上PstI位点。以pRB12 9质粒为模板 ,PCR扩增得到一条长约 1 4kb的片段 ,经酶切鉴定证明是TUB2基因。将此PCR产物经消化后与同样酶切的pTA质粒连接 ,构建出 pTA TUB2质粒并转化大肠杆菌。再以pTA TUB2质粒为模板 ,PCR扩增该目的基因 ,通过对其核苷酸序列分析证明构建的质粒是含TUB2基因的 pTA TUB2质粒。利用PEG方法 ,将该质粒转化毛壳菌 ,使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg/ml多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高 30 0倍以上 ,且转化稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变。结果表明质粒pTA TUB2对毛壳菌的转化率为 2 7/ (2× 10 5)。     

水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

转基因番木瓜pUC57-Papaya质粒标准分子的构建与适用性研究

构建了含番木瓜2个内标准基因、4个筛选靶标及3个转化体特异性片段的质粒分子pUC57-Papaya,进行了适用性验证实验。应用普通PCR和实时荧光定量PCR对其进行互换性评估;使用质粒分子对2个样品进行转基因含量测定。结果显示：质粒分子全部9个目的片段按照设计排列,序列完全一致;全部9个基因片段普通PCR和实时荧光PCR方法均能正确扩增得到预期结果,特异性、灵敏度与基因组DNA一致;全部9个基因构建标准曲线做定量测试时,与基因组DNA标准曲线斜率无显著差异,线性相关系数均大于0.99,其中内标准基因Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段的截距无差异;利用质粒分子测量2个样品的Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段拷贝数,计算转基因含量,结果与基因组DNA一致;测序结果显示各片段拷贝数比值为1,质粒DNA拷贝数浓度为(2.54±0.10)×10⁶ copies/μL。构建的标准质粒分子可代替基因组DNA用于定量检测,也可作为转基因番木瓜定性和定量检测用标准物质。     

南极嗜冷假单胞菌7197的分离和无机焦磷酸酯酶(PPase)基因ppa的克隆

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197.16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).从该菌的全基因组DNA中克隆到编码无机焦磷酸酯酶(PPase)的ppa基因完整的开放阅读框(ORF),其全长为531bp.该基因编码一个由176AA残基组成的分子量预计为19631 Da的PPase蛋白质,其氨基酸序列与Psychrobacter sp.273-4的PPase有97%的相似性,与Neisseria meningitidis Z2491的PPase有79%的相似性,与Mannheimia succiniciproducens MBEL55E的PPase有75%的相似性.     

乙肝表面抗原S2S基因在蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2S片段从乙肝病毒中扩增得到,将其插入到蓝藻热休克表达载体pEUTMT1中,构建成表达重组质粒pES2ST1.将蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的总染色体与质粒pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒.经转化筛选得到蓝藻Synechococcus sp.PCC7942转化藻株.PCR和Southern 杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中.转化藻通过热诱导后,Northern-blot结果呈阳性,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达,检测含量约为0.78～0.64ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10-6～1.5×10-6.     

鸭疫里默氏杆菌Ⅰ型磷酸二酯酶基因的发现及其分子特征分析

以兔抗鸭疫里默氏杆菌（RA）阳性血清对RA血清1型CH-1株表达型DNA文库中已通过蓝白斑筛选的一个阳性克隆进行了原位杂交筛选。经过5次免疫筛选后,阳性斑经过体内删除,噬菌粒经酶切分析和序列测定,得到一段4434bp的插入DNA片段。运用NCBI的BLASTN、BLASTP、ORF Finder、Conserved Domains、EMBL的FASTA等程序对该片段中的一个命名为ORF1689的开放阅读框架进行了全面的生物信息学分析。结果显示ORF1689起始密码子上游存在核糖体结合位点,完整ORF含1689bp,编码562个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为59．5kD,等电点为5．82。0RF1689具有phosphodiest蛋白家族的保守区域,与丙杆菌属的Caulobacter sp．K31、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp．）、Sphingopyxis alaskensis和Novosphingobium aromaticivorans的Ⅰ型磷酸二酯酶基因的氨基酸序列同源性分别为49．283％、38．716％、38．693％和38．313％,表明该基因是一种新的Ⅰ型磷酸二酯酶基因。该研究结果对阐明Ⅰ型磷酸二酯酶的生物学功能和RA的生理特性与致病机理提供了理论基础和实验数据。     

油菜叶绿体定点转化载体的构建及其杀虫性

首先从油菜叶绿体基因组克隆得到包含ｒｐｓ７基因在内的１．０ｋｂＤＮＡ片 包含ｎｄｈＢ基因在内的２．４ｋｂＤＮＡ片段,同时从苏云芽孢杆菌质粒上克隆得到一个全长３．５ｋｂ的ＢＴ杀虫蛋白基因ｃｒｙ１Ａａ。然后以ｒｐｓ７和ｎｄｈＢ基因作为同源重组片段,成功构建了包含Ｂｔ杀虫蛋白和ａａｄＡ抗壮观霉素基因的油菜叶绿体定点转化载体,并对克隆菌体总蛋白进行了生物杀虫试验。结果表明,Ｂｔ杀虫蛋白基因能够得到表达,并     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

慢生型大豆根瘤菌nfeC基因的克隆及序列分析

通过亚克隆,将重组质粒pGXN201中与nfeC基因同源的片段定位在4kbClaI XbaI片段上,序列分析表明该片段全长4038个碱基,该片段上含有一个完整的阅读框架,该阅读框架编码一个含275个氨基酸的多肽,与已报道的nfeC基因编码的蛋白质具有93%的同源性。     

水稻白叶枯病菌无毒基因的研究初报

报道了用基因标签法克隆水稻白叶枯病菌无毒基因的研究过程。通过接合实验，将Ｔｎ５引入水稻白叶枯病菌日本系统５号小种中去，在ＬＢ＋Ｋｍ平板上筛选了２５００个接合子；用剪叶接种法，将接合子接种水稻品种ＩＲ２６，得到了４个无毒基因突变体，分别用粘粒载体ｐＳａ７４７和质粒载体ｐＵＣ１９构建了ＪＸＯＶ核基因文库和无毒基因探针，采用菌落原位杂交法在基因库中钓取了１３个无毒基因克隆。该无毒基因片断在此病原的不同小     

一种改进的用高拷贝质粒制备BAC载体的新方法

介绍了一种改进的使用高拷贝质粒制备BAC载体的简便有效的方法，我们同时使用从高拷贝质粒pCUGIBACl制备的和用传统方法从单拷贝质粒pIndigoBAC-5制备的两种载体，比较了这两种载体与玉米大片段DNA连接所构建的BAC文库。结果表明在使用这两种BAC载体构建的BAC文库中，所获得的转化体数目，及在BAC克隆中插入的DNA片段的大小和BAC克隆的稳定性等方面都相同，从而证明本文所介绍的从高拷贝质粒pCUGIBACl来制备BAC载体是一种更方便的方法，它能使BAC文库的构建更为高效。     

转基因玉米pUC57-BT11质粒标准分子的构建与适用性研究

构建了含有转化体特异性片段（BT11-93bp）和玉米的内标准基因片段（zSSIIb-151bp）的质粒分子pUC57-BT11,经酶切和测序验证后,对其特异性进行检查。采用测序和荧光定量PCR法对该质粒分子进行定值,结果为1.01±0.01(k=2)。通过质粒分子和基因组DNA产生的内源和外源基因比较,发现两者标准曲线斜率无显著差异,线性相关系数均≥0.99。利用pUC57-BT11质粒分子对已知含量的转基因基体标准物质进行转基因含量测定,结果发现采用pUC57-BT11质粒分子对标准物质的测定结果与其标准值一致,表明pUC57-BT11质粒分子可作为转基因玉米BT11转化体特异性的定性和定量检测用标准物质。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共和固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因（ｄｃｔＡＢＤ）经ｐＩＪ２９２５克隆到广宿主、稳定性质粒ｐＴＲ１０２上,获得诱导型表达的重组质粒ｐＨＮ２０２。在此基础上再引入来自ｐＤＢ３０所含的发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）作分子标记,以ｐＴＲ１０２为基础建成带有ｄｃｔＡＢＤ和ｌｕｘＡＢ的重组质粒ｐＨＮ２０５。＃? ｄｇ ｕｓ ｓｇ ｒｕｖ ｗｇｋ ｌｆｔｑ,ｕ     

转基因棉花Mon15 985 质粒标准物质多家验证实验研究及不确定度分析

对转基因棉花Mon15985实时荧光定量PCR方法进行了方法确认,组织多家实验室进行协同实验验证,对该标准物质参考值进行测定。经统计分析,得出Mon15985质粒分子的参考值为1.02,扩展不确定度为0.04（k=2）。质粒分子与转基因棉花Mon15985的基因组DNA相比,无论是扩增斜率还是线性相关性,均具有可替代性,该棉花转基因Mon15985质粒标准物质,可作为分析检测标准提供相关部门使用。     

The characteristics and transfection efficiency of PEI modified by biodegradable poly(β-amino ester)

To improve the cytotoxicity of PEI25k and the transfection efficiency of poly(β-amino ester) with DNA, we synthesized a poly(β-amino ester), PEDP, bearing ester linkages in the backbone and tertiary amines in the backbone and side chain and prepared a binary mixture, PEDP–PEI25k, using physical blending meyhod. Both poly(β-amino ester) PEDP and binary mixture PEDP–PEI25k, readily self-assembled with plasmid DNA (pCMV-β gal) in a HEPES buffer, were characterized by dynamic light scattering. The results reveal that PEDP–PEI25k was able to self-assemble plasmid DNA into PEDP–PEI25k/DNA nano-complexes small enough to enter a cell through endocytosis. Titration studies were performed to determine the buffering capacities of PEDP and PEDP–PEI25k. The COS-7 cell viabilities in the presence of PEDP and PEDP–PEI25k were studied. At low mass ratio of PEDP/PEI25k (1/1), it is found that the transfection curve of PEDP–PEI25k/DNA bearing a maximum peak is similar to that of PEI25k/DNA. In addition, the PEDP–PEI25k/DNA complexes were able to transfect COS-7 cells in vitro with a high efficiency comparable to a well-known gene carrier PEI25k/DNA. The results indicate that binary mixture PEDP–PEI25k is an attractive cationic carrier for gene delivery and an interesting candidate for further study.