西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

黑曲霉 G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该生淀粉糖化酶基因组DNA 序列编码区长2 172 bp,cDNA编码区长1 923 bp,该基因含有4个内含子,共编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列,该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点,软件预测出该酶的分子质量约为68 ku,等电点为pH值4.07。     

烟色红曲霉Lig4基因克隆鉴定与蛋白序列分析

为了分离鉴定烟色红曲霉中可能编码非同源重组调控因子的Mflig4基因,先后通过简并引物PCR和染色体走读方法获得烟色红曲霉Mflig4基因,采用多种分子生物学软件对其基因序列和蛋白质性质等进行分析,并构建真菌Lig4蛋白的系统发育树。结果显示,Mflig4基因包括3个内含子,位置分别为70～155,2 244～2 363,2 436～2 526bp。Mflig4基因全长为3 120bp,编码基因为2 823bp。编码产物长度940aa,蛋白质分子量为104kDa,等电点为7.87,预测显示Mflig4蛋白在细胞中定位于细胞核中。对不同物种间Mflig4蛋白遗传进化树分析,发现烟色红曲霉的Mflig4蛋白在进化关系上与其它真菌都有较高的亲缘关系。     

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase,ADC）基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5＇非翻译区（5＇Untranslated region,5＇-UTR）、226bp的3＇非翻译区（3＇Untranslated region,3＇-UTR）和2 079bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75.1kD的蛋白质。5＇-UTR中含有12bp的uORF（Upstream open readingframe）,编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a（＋）-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21（DE3）,SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E.coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

烟草NCED3 基因的克隆及其干旱胁迫表达分析

为揭示9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 在烟草生长发育过程中的功能,通过同源克隆方法获得烟草品种K326 类胡萝卜素降解关键基因NCED3 两个cDNA 全长序列。序列分析表明:K326 NCED3-1 和NCED3-2 基因分别包含一个1842bp 和1830bp 的开放读码框(ORF), 各编码613 个和609 个氨基酸。预测蛋白质分子量分别为68177.8 Da 和67754.2Da,理论等电点(pI) 各为7.66 和7.28。跨膜区预测、亲水性和信号肽分析表明很可能是定位于线粒体膜上的亲水性跨膜蛋白。二级结构预测模型显示此蛋白结构以β 折叠和无规则卷曲为主。蛋白三级结构预测分析表明NCED3-1 与NCED3-2 空间结构极为相似。PEG6000 胁迫分析表明,干旱胁迫可以诱导NCED3 基因表达以及内源ABA 的积累。且在处理12h 之前,NCED3 表达与ABA 累积速度均呈现升高趋势,之后逐渐降低。研究结果为解析NCED3 在烟草抗旱方面的功能提供一定的研究基础。      

白菜型油菜八氢番茄红素合酶基因BrPSY的克隆与序列分析

八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成途经的第一个关键限速酶,对类胡萝卜素合成起着重要的控制作用。本研究利用电子克隆技术,从油菜EST数据库中找到与拟南芥PSY,基因高度同源的油菜EST序列,通过人工拼接及lit—PCR、RACE的方法,克隆得到白菜型油菜BrPSY基因全长eDNA的序列,提交GenBank,被命名为BrPSY（GenBank登记号EUl38883）。BrPSY包含168bp的5’前导序列、69bp的3’不翻译序列和1278bp的完整开放读码框（ORF）,编码47．6kOa的蛋白质。序列比对结果表明,BrPSY蛋白与其它植物的PSY蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,BrPSY与拟南芥亲缘关系最近。在全长eDNA序列的基础上,设计引物从白菜型油菜DNA中克隆得到BrPSY基因的全长DNA序列,含有7个外显子和6个内含子。     

芸薹属种子贮藏蛋白质组分的比较研究

对组成芸薹属3个基本种和3个复合种的种子贮藏蛋白亚基组成进行了SDS-PAGE比较分析,结果表明：不同种间的种子贮藏蛋白具有一定的差异,表现出丰富的多态性;6个种共有24条亚基带,并各自具有特征蛋白谱带。利用贮藏蛋白亚基条带的信息,分析了种间的蛋白相似度,并进行了聚类分析。供试材料分为两类：Ⅰ类为白菜型油菜、甘蓝与甘蓝型油菜;Ⅱ类为黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥。     

甘蓝型油菜BnKNAT2基因克隆和功能分析

为分析甘蓝型油菜中调控分生组织细胞特异分化的KNOX基因家族成员KNAT2,从品种中双11号中分离克隆了BnKNAT2基因,ORF长984bp,由5个外显子组成,该基因编码327个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质包含有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN结构域,属I类KNOX蛋白。甘蓝型油菜中BnKNAT2存在4个拷贝,在主花序（原基）、授粉后7d的角果和茎中活跃表达。利用35S启动子构建了BnKNAT2的超表达载体（pD1301SBnKNAT2）转化拟南芥野生型Col-0。21个转基因株系（T2）的叶片呈现不同程度卷曲、蜷缩以及波纹状叶缘。另外,BnKNAT2转基因株系开花期相比野生型明显推迟。     

甘蓝型油菜AnnBn1基因的克隆和表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术从甘蓝型油菜抗旱品系Q2中克隆了膜联蛋白（annexin）基因,命名为AnnBn1（GenBank登录号HM244482）,并对其进行了表达分析。AnnBn1的开放阅读框长度为954bp,编码317个氨基酸。序列分析推测AnnBn1基因编码的氨基酸序列含有4个重复的结构域及钙离子结合位点,与拟南芥、番茄、棉花和玉米等物种的膜联蛋白具有较高的同源性。荧光定量PCR结果发现AnnBn1基因在Q2的根、茎、叶、芽等组织中均有表达,而且表达量基本相同。对3叶期幼苗进行10%PEG（聚乙二醇）溶液模拟干旱时发现,干旱胁迫后30h内,AnnBn1基因在茎、芽中的表达量升高了2～4倍,而在叶、根中显著升高了10倍以上。AnnBn1基因表达峰值也具有时空特点,干旱胁迫后20h茎和芽中表达量高,而在30h之后叶和根中表达量高。     

欧洲野生甘蓝的核质遗传多样性和群体遗传结构分析

为了解欧洲野生甘蓝遗传背景,以栽培甘蓝、甘蓝型油菜和白菜型油菜作对比,对引进的7个生态地理群体共80份野生甘蓝材料进行了核质遗传多样性和群体遗传结构分析。利用10对特异性SSR引物分析叶绿体基因组多样性,获得8个差异性标记,将参试94份材料划分为3类,即甘蓝（含栽培和野生甘蓝）、甘蓝型油菜和白菜型油菜;包括6种单倍型,其中野生甘蓝2个,甘蓝型油菜3个,白菜型油菜1个。利用6对SRAP引物对核基因组多样性进行分析,获得75个多态性标记;聚类及遗传结构分析表明7个野生甘蓝群体中,F、D、G三个群体聚为独立的亚类,E群体大部分单株归于G亚类。其它3个群体A、B、C则相互混杂在一起。野生甘蓝群体Nei＇s基因多样性指数（H）和Shannon’s指数（I）分别为0.301 3和0.461 1。分子方差分析（AMOVA）表明野生甘蓝以群体内变异为主,占80%;群体间变异仅占20%。结果显示引进的野生甘蓝群体核质遗传多样性丰富。     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。     

PURIFICATION AND PROPERTIES OF TWO ACID PEROXIDASES FROM BRUSSELS SPROUTS (Brassica oleraceae L.)

An acid peroxidase isoenzyme (A1) from Brussels sprouts (Brassica oleraceae L.) has been purified while another isoenzyme (A2) has been partially purified. Studies of their properties leading to a potential application in immunoassays as an alternative to horseradish peroxidase were conducted. Isoenzyme A1 was purified 503 fold, through ammonium sulfate and acetone fractionation, and successive chromatography on DEAE-cellulose, Sephadex G-100 and Mono-S (FPLC system) columns. Isoenzyme A1 had a pI of 4.0, a molecular weight of 90 kDa, and contained two identical molecular weight subunits. Preliminary studies indicated a pI of 4.7 for isoenzyme A2. ABTS [2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid)] K_m values (0.2 mM) for both isoenzymes are 20 times lower than those reported for commercial horseradish peroxidase anionic isoenzymes. Optimum pH for activity of isoenzymes A1 and A2 were 4.3 and 4.5, respectively. Optimum temperature for isoenzyme A1 was 57C, with an activation energy for inactivation of 148.8 kJ/mol.