金雀异黄酮对脂多糖处理的软骨细胞增殖抑制的拮抗及抗炎作用

目的观察金雀异黄酮(Genistein,GEN)对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)处理的软骨细胞增殖抑制的拮抗及抗炎作用。方法体外培养新西兰兔关节软骨细胞,将细胞分为正常对照组、LPS单独处理组(10μg/ml)及LPS(10μg/ml)+不同剂量GEN(1、5、10、15μg/ml)处理组,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性,RT-PCR法检测各组细胞相关炎性因子IL-1β、诱导型一氧化氮合酶iNOS、转录调节因子p53基因mRNA的表达。结果剂量为1μg/ml的GEN能拮抗软骨细胞经LPS处理后引起的增殖活性降低,且能抑制经LPS处理后软骨细胞IL-1β、iNOS、p53基因mRNA的表达。结论 GEN对LPS处理的软骨细胞可能具有拮抗其增殖抑制及抗炎的作用。     

绿茶提取物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯对人卵巢癌HO-8910细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响

目的研究绿茶提取物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Epigallocatechin-3 gallste,EGCG)对人卵巢癌HO-8910细胞增殖及细胞内Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响,探讨EGCG抑制卵巢癌细胞生长的机制。方法用不同浓度的EGCG(10、20和40μg/ml)处理体外培养的人卵巢癌HO-8910细胞不同时间(24、48和72 h),采用MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞周期的变化;RT-PCR和Western blot分别检测细胞中β-catenin和下游靶基因CyclinD1 mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果 EGCG可明显抑制HO-8910细胞的增殖活力,且抑制作用呈剂量-时间依赖性(P<0.05);40μg/ml EGCG干预后,HO-8910细胞主要阻滞于G0/G1期,且在48 h阻滞作用最为明显;EGCG可显著降低HO-8910细胞中β-catenin和CyclinD1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平,且呈剂量-时间依赖性(P<0.01)。结论 EGCG可抑制HO-8910细胞的增殖,其机制可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关,提示EGCG可能在卵巢癌的治疗中具有一定的应用前景。     

人羊膜上皮细胞旁分泌作用及其对糖尿病大鼠创面血管再生的影响

目的研究人羊膜上皮细胞(human amnioticepithelial cells,hAECs)旁分泌情况及其在糖尿病皮肤损伤大鼠模型中皮肤愈合及血管再生的作用。方法采用流式细胞术对hAECs表型进行分析;ELISA方法检测hAECs培养上清中旁分泌因子含量;划痕试验检测hAECs条件培养基对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)划痕的愈合作用,确定旁分泌作用对其迁移能力的影响;对糖尿病大鼠进行皮肤损伤造模,检测经h AECs治疗后,皮肤中CD34表达及Cyclin D1基因mRNA转录水平。结果 hAECs表面高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD73、CD105及胚胎干细胞表面标志SSEA4,低表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90及造血干细胞表面标志CD45、CD34、HLA-DR;可大量分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),72 h时表达量显著高于24和48 h及培养基对照组(P 0. 05);HUVECs划痕后24和48 h,两种浓度条件培养基组对细胞的愈合作用均较基础培养基对照组强,差异有统计学意义(P 0. 01),且两种浓度条件培养基组细胞迁移率差异无统计学意义(P 0. 05);hAECs治疗后糖尿病大鼠皮肤中CD34表达及Cyclin D1基因mRNA转录水平均显著高于相同取材时间条件下的未治疗组,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论 hAECs可大量分泌VEGF,并能够通过旁分泌作用促进体外HUVECs迁移、增殖及糖尿病大鼠皮肤血管再生。     

苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达的影响

目的探讨苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1 SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达的影响。方法用不同浓度的苦参碱(0.5、1.0、2.0 g/L)处理TF-1细胞,另设对照组(不加苦参碱)。苦参碱作用48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测各组TF-1细胞中SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的表达水平,并分析SALL4基因与β-catenin、C-myc及Cyclin DI表达的相关性;Western blot法检测各组TF-1细胞中SALL4蛋白的表达水平。结果经不同浓度苦参碱处理48 h后,TF-1细胞中SALL4、β-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达水平及SALL4蛋白的表达水平与对照组相比,均明显下降,且呈浓度依赖性(P<0.05);SALL4基因与β-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达明显相关(r s值分别为0.912、0.818和0.832,P均<0.01)。结论苦参碱对TF-1细胞中SALL4基因和蛋白表达及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的抑制可能在抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡过程中起重要作用。     

人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的真核表达、纯化及活性鉴定

目的利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,以甲醇诱导表达,并进行Western blot检测及金属螯合层析纯化。采用MTT法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果重组表达质粒pPIC9K-Vasostatin(120～180aa)经菌落PCR、酶切和测序鉴定,证明构建正确。经Western blot检测可见一条特异条带,纯化后的蛋白纯度达88.76%,浓度为300μg/ml,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖。结论人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)可在毕赤酵母中以分泌形式表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。     

姜黄素对转化生长因子-β1诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9表达及其侵袭能力的影响

目的研究姜黄素对转化生长因子-β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP-9)表达及其侵袭能力的影响,探讨姜黄素在防治TGF-β1诱导的乳腺癌侵袭转移中可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测姜黄素对MDA-MB-231细胞的细胞毒性作用。将MDA-MB-231细胞分为阴性对照组(无血清RPMI1640培养基/DMSO)、TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基/DMSO+10 ng/ml TGF-β1),姜黄素+TGF-β1处理组(无血清RPMI1640培养基+5、7.5、10μmol/L姜黄素+10 ng/ml TGF-β1)。处理24 h后,采用侵袭小室试验观察细胞的侵袭能力;处理不同时间后,采用Western blot法检测细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2以及p-p38的表达,明胶酶谱法检测各组细胞上清液中MMP-9的活性变化;以ERK特异性抑制剂PD98059、p38特异性抑制剂SB202580、姜黄素和/或TGF-β1处理细胞48 h,采用Western blot和明胶酶谱法检测MMP-9的表达。结果低浓度姜黄素(≤10μmol/L)对MDA-MB-231细胞无明显的细胞毒性作用;姜黄素呈剂量依赖性明显减少了TGF-β1诱导的细胞穿膜数量(P<0.001);姜黄素可显著抑制TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9、p-Smad2、p-ERK1/2及p-p38蛋白的表达,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05);姜黄素随浓度的增加,对TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞MMP-9活性的抑制作用明显增强(P<0.05);PD98059抑制MMP-9蛋白表达及活性的作用与姜黄素相似,而SB202580对MMP-9无明显影响。结论姜黄素可能通过TGF-β/Smad、TGF-β/ERK信号通路下调TGF-β1诱导的MMP-9的表达及其活性,从而抑制肿瘤的侵袭能力。     

乌司他丁和泰索帝对人乳腺癌细胞MDA-MB-231中uPA、uPAR、ERK表达的影响

目的探讨乌司他丁(Ulinastatin,UTI)和泰索帝(Taxotere,TXT)对体外培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中u-PA、uPAR、ERK表达的影响。方法将MDA-MB-231(ER-)细胞分为4组:UTI组(UTI 800 U/ml)、TXT组(TXT 3.7μg/ml)、UTI+TXT组(UTI 800 U/ml+TXT 3.7μg/ml)、对照组(等量生理盐水)。给药后24 h,分别采用荧光定量RT-PCR检测各组细胞中uPA、uPAR、ERK基因mRNA的水平,Western blot法检测各组细胞中uPA、uPAR、p-ERK1/2蛋白的表达水平。结果 UTI组和UTI+TXT组MDA-MB-231(ER-)细胞中uPA和uPAR基因mRNA的水平均明显低于对照组(P<0.05),而TXT组中二者的表达水平均明显高于对照组(P<0.01),各组间ERK基因mRNA的水平差异无统计学意义(P>0.05);UTI组和UTI+TXT组中uPA、uPAR和p-ERK1/2蛋白的表达水平均明显低于对照组(P<0.01),而TXT组中3种蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论UTI可抑制MDA-MB-231细胞中uPA、uPAR、p-ERK的表达,而TXT可上调三者的表达。     

乌司他丁和泰索帝对乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响及其机制

目的探讨乌司他丁(Ulinastatin for injection,UTI)和泰索帝(Taxotere,TXT)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ER-)增殖、侵袭及血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor,bFGF)、神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)mRNA转录水平的影响。方法体外培养MDA-MB-231细胞,随机分为4组:对照组(只加RPMI1640培养液)、UTI组(终浓度800 U/ml)、TXT组(3.7μg/ml)、UTI+TXT组(800 U/ml UTI+3.7μg/ml TXT)。给药后24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖水平;24 h,采用Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力,实时荧光定量PCR法检测细胞VEGF-C、bFGF、NGF基因mRNA的转录水平。结果 UTI、TXT及UTI+TXT呈时间依赖性抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P均<0.05),并显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力(P均<0.01)及VEGF-C、bFGF、NGF基因mRNA的转录水平(P均<0.05);TXT组与UTI+TXT组NGF基因mRNA转录水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);对细胞增殖、侵袭及VEGF-C、bFGF、NGF基因mRNA转录的抑制作用UTI+TXT>TXT>UTI。结论 UTI和TXT均可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭,UTI可增强TXT的抑制作用,其机制可能与下调VEGF-C、bFGF、NGF mRNA的表达有关。     

Netrin-1对肺泡上皮细胞钠离子通道α亚基的调控及其机制

目的研究Netrin-1对肺泡上皮细胞钠离子通道α亚基(epithelial sodium channelα-subunit,α-ENaC)表达的调控及其可能的机制,并探讨其在急性肺损伤(acute lung injury,ALI)及急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)中的作用。方法取对数生长期的A549细胞,用相同浓度的Netrin-1(500μg/L),分别作用0、3、6、12、24和48 h,用不同浓度的Netrin-1(0、0.5、5、50和500μg/L),作用12 h。将A549细胞分为药物组(500μg/LNetrin-1)、抑制组(1μmol/L PSB1115+500μg/L Netrin-1)和对照组(仅加RPMI1640培养基),培养12 h。RT-PCR法分别检测各组α-ENaC基因mRNA的转录水平;Western blot法检测各组α-ENaC蛋白的表达水平。结果相同浓度下,Netrin-1作用A549细胞6 h后,α-ENaC基因mRNA相对转录水平及蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05),作用12 h时达最高;相同时间内,Netrin-1浓度大于5μg/L时,α-ENaC基因mRNA相对转录水平及蛋白的相对表达量均明显高于对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性,浓度为500μg/L时达最高;药物组α-ENaC基因mRNA相对转录水平及蛋白相对表达量均明显高于对照组及抑制组(P<0.05),PSB1115可明显抑制α-ENaC基因mRNA的转录和蛋白表达。结论 Netrin-1可通过腺苷A2b受体途径,从基因水平上调α-ENaC的表达,有益于ALI及ARDS的预后。     

联氨基姜黄素对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响及其机制

目的探讨联氨基姜黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响及其机制。方法采用MTT法检测联氨基姜黄素对MCF-7细胞的抗增殖效应,Hochest33258染色观察细胞形态学变化,流式细胞术分析细胞的周期分布和凋亡情况,Western blot检测MCF-7细胞中Bcl-2、Bax、Cyclin D1和Survivin蛋白的表达变化。结果联氨基姜黄素可抑制MCF-7细胞的增殖,IC50为2.56μmol/L,而姜黄素的IC50为21.22μmol/L;联氨基姜黄素染色24 h后,MCF-7细胞出现核荧光强度增强、颗粒状荧光等凋亡特征;凋亡细胞比率明显增加,并可阻滞细胞周期于G1期,且呈一定的剂量依赖性;联氨基姜黄素可使MCF-7细胞中Bcl-2、Cyclin D1、Survivin蛋白表达水平明显降低,而Bax表达增加。结论联氨基姜黄素具有抑制MCF-7细胞增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期于G1期的作用,其机制可能与Bcl-2、Bax、Cyclin D1、Survivin蛋白的表达改变有关。     

辛二酰苯胺氧肟酸对人脐静脉内皮细胞增殖及血管形成的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylases inhibitor,HDACi)辛二酰苯胺氧肟酸(Suberoy-lanilide hydroxamic acid,SAHA)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖及血管形成能力的影响。方法收集处于对数生长期的HUVEC,以不同浓度的SAHA分别处理24和48 h,另设不加SAHA的对照组,采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,并计算增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。采用流式细胞术检测经15μmol/L SAHA处理48 h的HUVEC凋亡和细胞周期,基质胶体外血管生成试验检测HUVEC的体外成管能力,Western blot法检测HUVEC细胞周期及凋亡相关蛋白的表达水平。结果随着SAHA浓度的增加及作用时间的延长,其对HUVEC增殖的抑制作用增强,SAHA浓度高于80μmol/L时,抑制率增加不明显,24和48 h的IC50值分别为60.53和30.49μmol/L;经15μmol/L SAHA处理48 h,与对照组相比,HUVEC的凋亡率明显增加(P<0.001),S期细胞比例明显升高(P<0.001),G0/G1期比例明显降低(P<0.001),体外成管能力明显下降,P21、caspase-3激活型、caspase-9酶原和激活型蛋白的表达水平均明显升高(P<0.001)。结论 SAHA能够抑制HUVEC增殖及体外血管形成能力,并使P21、caspase-3和caspase-9蛋白水平上调,为肿瘤的治疗提供了一种新的思路。     

重楼提取液对人结肠癌SW480细胞增殖的影响及其作用机制

目的观察重楼提取液对人结肠癌SW480细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法采用不同浓度(10、20、40、80μg/ml)的重楼提取液,分别作用于体外培养的SW480细胞12、24、36和48h,采用MTT法检测其对SW480细胞的抑制率;并以半数抑制浓度的重楼提取液与体外培养的SW480细胞作用24h后,显微镜下观察细胞形态,并通过流式细胞术分析其对SW480细胞细胞周期的影响,RT-PCR和Western blot法分别测定SW480细胞干细胞因子(SCF)mRNA和蛋白表达的变化。结果各浓度重楼提取液对SW480细胞均有不同程度的抑制作用,且存在剂量-效应和时间-效应关系,重楼提取液作用后的SW480细胞出现变性、坏死的形态改变;经重楼提取液处理24h后,SW480细胞在S期的分布比例下降,G0-G1期和G2/M期细胞分布增多(P<0.05);同时SCF表达增高(P<0.05)。结论重楼提取液可能通过抑制肿瘤细胞的蛋白质与DNA合成,抑制肿瘤细胞的有丝分裂,进而抑制SW480细胞增殖,且其作用机制可能与SCF无关。     

曲古抑菌素A与罗格列酮联合应用对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的研究组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体罗格列酮(ROZ)联合应用对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法首先用不同浓度的TSA和ROZ分别作用于SGC-7901细胞,MTT法检测二者对细胞增殖的抑制作用,以筛选出合适的联合作用浓度。将SGC-7901细胞随机分为对照组、TSA组、ROZ组和TSA+ROZ组,加入相应的药物处理48h后,MTT法检测各组细胞增殖抑制率,并应用流式细胞仪检测细胞周期情况,RT-PCR检测PPARγ和CyclinD1基因mRNA的转录水平。结果对SGC-7901细胞增殖抑制作用不显著的低剂量TSA(40nmol/L)与ROZ联用时,能显著增强ROZ对细胞增殖的抑制作用,TSA+ROZ组G0/G1期细胞比例较单用TSA或ROZ组明显增加,且CyclinD1基因mRNA转录水平明显下降;TSA作用于细胞后,PPARγ基因mRNA转录水平较对照组明显升高,而ROZ单独作用后,细胞PPARγ基因mRNA转录水平无改变。结论TSA可明显增强ROZ对SGC-7901细胞增殖的抑制效应,提示HDAC在SGC-7901细胞内可能具有抑制PPARγ的作用。     

PLCε调节肾细胞癌血管生成的作用机制

目的探讨血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在PLCε-NF-κB信号通路中影响肿瘤血管生成的作用机制。方法将PLCε-shRNA表达质粒pGenesil-PLCε转染人肾透明细胞癌786-0细胞株,沉默磷脂酶Cε(Phos-pholipase C epsilon,PLCε)基因的表达,采用RT-PCR及Western blot检测转染细胞中PLCε、NF-κB和VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;应用NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理细胞后,采用MTT法检测BAY11-7082对786-0细胞增殖的抑制作用,RT-PCR和Westernblot检测VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化。结果重组质粒pGenesil-PLCε可明显抑制PLCε基因mRNA和蛋白水平的表达,抑制率分别为71.43%和50.01%,并明显下调NF-κB和VEGF基因mRNA和蛋白水平的表达;BAY11-7082可明显抑制786-0细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性;应用BAY11-7082后,VEGF基因mRNA和蛋白的表达均被明显抑制。结论 PLCε可能通过抑制NF-κB基因的表达,从而抑制NF-κB依赖性基因VEGF的表达,进而影响肾细胞癌血管生成。     

血管内皮生长因子受体3和神经纤毛蛋白2对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨分别阻断和联合阻断血管内皮生长因子受体3(Vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)及神经纤毛蛋白2(Neuropilin 2,NRP2)基因的表达对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和凋亡的影响。方法将SGC-7901细胞株分为3大组,VEGFR3阻断组、NRP2阻断组和VEGFR3+NRP2阻断组,各大组中又包含空白对照组、脂质体转染组、无义链转染组(NSODN组)和不同浓度反义链转染组(ASODN组)。转染后的各组SGC-7901细胞株经RT-PCR法检测VEGFR3-mRNA及NRP2-mRNA的转录水平。分别采用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡情况。结果反义链转染组VEGFR3-mRNA和NRP2-mRNA的转录水平明显低于其各自的空白对照组、脂质体转染组和NSOND组,表明该组成功阻断基因VEGFR3和NRP2的表达。各组细胞的增殖和凋亡情况差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量和时间依赖性。在相同条件下,单独转染VEGFR3-ASODN组对胃癌细胞增殖的抑制及促凋亡作用优于单独转染NRP2-ASODN组,而联合转染组对细胞增殖的抑制及促凋亡作用最明显。结论阻断VEGFR3基因的表达对细胞增殖凋亡的影响大于阻断NRP2基因,联合阻断两个基因的表达,对细胞增殖和凋亡的影响明显大于单独阻断组。     

氨氯地平对小鼠肝癌H_(22)细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响

目的探讨氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响。方法用不同浓度的氨氯地平作用小鼠肝癌H22细胞,采用MTT法检测细胞的增殖水平,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,免疫组化及RT-PCR法检测细胞周期蛋白CyclinB1和肿瘤抑制基因p53在蛋白水平和基因水平的表达。结果氨氯地平(1.75×10-3、3.5×10-3、7×10-3、14×10-3、28×10-3mg/ml)作用24、36、48h,均可抑制细胞增殖,作用48h的半数抑制浓度(IC50)为13.4μmol/L;氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期G2期具有阻滞作用且可使细胞发生凋亡;氨氯地平作用后的小鼠肝癌H22细胞周期蛋白CyclinB1的表达明显降低,p53表达明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氨氯地平能显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,并通过下调G2期周期蛋白CyclinB1水平和上调肿瘤抑制基因p53的表达而达到抗肿瘤效果。