无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。     

中空纤维超滤和疏水层析大规模纯化质粒DNA

目的建立适合大规模纯化质粒DNA的工艺。方法采用碱裂解、中空纤维超滤浓缩、疏水层析、分子筛等分离技术纯化质粒DNA。结果纯化后的质粒DNA纯度达95%以上,整个工艺流程总产率为58%,各项指标均符合药用质粒DNA质量标准。结论此纯化工艺简便,产率较高,为DNA疫苗大规模纯化奠定了基础。     

乳癌组织中人类表皮生长因子受体2蛋白的纯化及鉴定

目的建立乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白的纯化方法。方法采用新鲜的乳腺癌组织制备匀浆液,经60%饱和硫酸铵盐析沉淀法进行乳腺癌组织蛋白的粗提;再通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和两次Sephacryl S-200分子筛层析进一步纯化HER2蛋白;纯化蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果纯化后HER2蛋白相对分子质量为185 000;HER2蛋白可与兔抗人HER2多克隆抗体发生特异性结合。结论建立的纯化方法获得了具有免疫学活性的HER2蛋白,为HER2单克隆抗体的制备奠定了基础。     

重组白喉毒素无毒突变体CRM_(197)柱复性及纯化工艺的优化

目的优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺。方法将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的最佳工艺。结果包涵体经Sephacryl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95%以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+50 mmol/L NaCl的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡。结论已筛选出rCRM197复性及纯化的最佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化。     

抗人ICAM-1单链抗体表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单链抗体(ScFv)的表达载体,并在大肠肝菌中表达。方法从分泌ICAM-1单抗的杂交瘤细胞中提取RNA,用RT-PCR扩增抗体VH和VL基因,重叠延伸PCR扩增人ICAM-1-ScFv基因,将其连接到pET-22b(+)载体上,转化大肠杆菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物纯化及复性后,检测特异性及活性。结果序列分析表明抗ICAM-1 ScFv基因全长为744bp,编码247个氨基酸,其中含357bp的VH基因片段和342bp的VL基因片段。表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的32%。经变性和复性后,纯度达80%以上,复性率达25%。Western blot和ELISA检测,ScFv均可与ICAM-1抗原特异性结合。细胞黏附试验表明ScFv能抑制ICAM-1与HSB2细胞间的黏附,其作用稍弱于亲本mAb。结论已成功构建了抗人ICAM-1的ScFv表达载体,其表达产物具有抗体特异性和活性。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

重组人抗HBs-Fab抗体的纯化及结构分析

目的研究重组人抗HBs-Fab抗体的纯化工艺,并对其结构等特性进行分析。方法采用离子交换-分子筛层析法分离纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并经ELISA检测其抗体活性,等电聚焦电泳法检测其等电点(pI),基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量和肽质量图谱。结果纯化的重组Fab抗体的纯度可达90%以上,经Sephacryl-100进一步层析后,纯度达99%以上,总收率可达80%以上。Fab抗体具有较好的抗体活性,其pI值为7·6,为一碱性蛋白,相对分子质量为50494,比其理论值约多2579·35,经Endoglycosidase H内切酶消化后的相对分子质量为49609,证明Fab的一级结构中有糖基化现象,且分布于Fab抗体的H链和L链上。胰酶酶解肽段中有21个与理论肽段相符,另检测到1对二硫键正确。结论已建立了重组人抗HBs-Fab抗体的稳定的纯化工艺,且Fab抗体的一级结构正确。     

重组人溶菌酶的分离纯化及鉴定

目的建立重组人溶菌酶(human lysozyme,h LYZ)的分离纯化方法,并对纯化产物进行鉴定。方法采用固液分离、膜过滤、疏水层析及离子交换层析对hLYZ进行分离纯化;SDS-PAGE及HPLC法检测hLYZ纯度;按《中国药典》二部(2015版)蛋清溶菌酶效价检查法检测其效价;Western blot法检测其特异性;基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其相对分子质量。结果该分离方法可获得单一组分的重组hLYZ;SDS-PAGE检测纯度达99%,HPLC分析纯度达98. 8%;纯化后的hLYZ可与抗人LYZ抗体特异性结合,活性为1. 2×105 U/mg,相对分子质量为14 697。结论建立的分离纯化方法易操作,成本低,得到的hLYZ纯度大于98%,该分离方法可用于hLYZ的规模化生产。     

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的　建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法　采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果　纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论　此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。     

大豆异黄酮的纯化工艺研究

采用大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖凝胶及反相硅胶RP-18等4种填料的柱层析法纯化大豆异黄酮。结果表明,四种层析填料的纯化效果均较好,大豆异黄酮纯度达30％以上,其中以葡聚糖凝胶为填料的柱层析法分离纯化效果最佳,纯度可达55．45％,提取率为90％。     

重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的　探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法　将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果　融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论　已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。     

抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51％,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。     

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。     

Soluble Cytoplasmic Expression and Purification of Immunotoxin HER2(scFv)-PE24B as a Maltose Binding Protein Fusion

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) is overexpressed in many malignant tumors. The anti-HER2 antibody trastuzumab has been approved for treating HER2-positive early and metastatic breast cancers. Pseudomonas exotoxin A (PE), a bacterial toxin of Pseudomonas aeruginosa, consists of an A-domain with enzymatic activity and a B-domain with cell binding activity. Recombinant immunotoxins comprising the HER2(scFv) single-chain Fv from trastuzumab and the PE24B catalytic fragment of PE display promising cytotoxic effects, but immunotoxins are typically insoluble when expressed in the cytoplasm of Escherichia coli, and thus they require solubilization and refolding. Herein, a recombinant immunotoxin gene was fused with maltose binding protein (MBP) and overexpressed in a soluble form in E. coli. Removal of the MBP yielded stable HER2(scFv)-PE24B at 91% purity; 0.25 mg of pure HER2(scFv)-PE24B was obtained from a 500 mL flask culture. Purified HER2(scFv)-PE24B was tested against four breast cancer cell lines differing in their surface HER2 level. The immunotoxin showed stronger cytotoxicity than HER2(scFv) or PE24B alone. The IC₅₀ values for HER2(scFv)-PE24B were 28.1 ± 2.5 pM (n = 9) and 19 ± 1.4 pM (n = 9) for high HER2-positive cell lines SKBR3 and BT-474, respectively, but its cytotoxicity was lower against MDA-MB-231 and MCF7. Thus, fusion with MBP can facilitate the soluble expression and purification of scFv immunotoxins.     

重组人白细胞介素-12(CHO细胞)的纯化及其活性

目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。     

疏水作用层析在重组大肠杆菌表达的rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化中的作用

目的建立rProEMAPⅡ/P43蛋白的纯化工艺,明确疏水作用层析(HIC)在纯化中的作用。方法采用由疏水作用层析、离子交换层析、亲和肝素层析组成的工艺对rProEMAPⅡ/P43蛋白进行纯化,并与由离子交换层析和亲和肝素层析组成的工艺相比较,分别进行总蛋白含量测定、SDS-PAGE分析目的蛋白含量及纯度检测。结果在pH为7·4~7·5时,采用HIC方法纯化的蛋白较不采用HIC法回收率提高了28·4%,纯化后rProEMAPⅡ/P43蛋白纯度为92%。结论在rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化过程中增加疏水作用层析,可以提高rProEMAPⅡ/P43蛋白收率。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的纯化与检定

目的研究双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺,并建立质控标准。方法首先对两工程菌(DH5α/pS2.S和DH5α/pFP)的高效发酵菌体采用碱裂解法进行质粒初提;然后通过三步柱层析(依次为分子筛层析、亲和层析、阴离子层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、超螺旋比例、内毒素等,最后对终产品质粒溶液进行全面质量检定。结果质粒初提液通过分子筛层析后,去除了大量的RNA、宿主DNA、内毒素等,再经亲和柱纯化后获得了高比例的超螺旋质粒DNA,达95%,最后经阴离子柱层析有效去除内毒素,并浓缩了质粒,质粒得率为0.9～1.1mg/g菌,质粒总回收率达78%。三批终产品全面质量检定均符合规定。结论建立了稳定的双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺及质量控制标准,为进一步研究奠定基础。