应用间接ELISA方法定量检测转基因抗虫玉米

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原 ,通过抗体 抗原 酶标抗体反应 ,建立了间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以快速检测转基因抗虫玉米中的Bt1表达蛋白 .用建立的ELISA法对 4种进口玉米实物样品进行了测定 ,实验结果得到了免疫印迹分析的验证 ,并与进口试剂盒方法的定量分析结果相一致     

转Bt基因水稻种子中Bt蛋白含量测定方法的研究

采用ELISA技术检测转Bt基因水稻中Bt蛋白的含量,判断水稻样品中是否含有转基因成分。利用研磨、酶标、孵育等技术对样品进行前处理。采用阳性质控物浓度等倍稀释方法,建立标准曲线,相关系数为0.997 4。用一系列不同转基因含量的标准基体材料,分析方法的最低检测限,灵敏度达0.1%。通过对我国进入生产性试验的转Bt基因水稻品系TT51-1和科丰6号的测试,表明该方法与普通PCR方法真实性和灵敏度一致,可以广泛应用于转Bt基因水稻及其粗加工产品的转基因成分检测。为转基因生物安全监管和安全性评价提供技术支撑。     

转基因玉米Bt176品系特异性环介导等温扩增检测方法的研究

根据转基因玉米品系Bt176外源插入片段与玉米基因组序列设计和筛选品系特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,最终建立转基因玉米品系Bt176的品系特异性LAMP检测方法.对该方法进行了灵敏度、特异性和稳定性评价.评价结果表明:该方法定性检测低限为0.5％,特异性和稳定性均达到100％.     

用PCR检测熟食中的转基因Bt-玉米

用8种已知并已发表的PCR（聚合酶链反应）引物组进行比较，用以测定熟食中转基因Bt“极产”玉米“event 176”的zein(玉米醇溶蛋白－－泽注）基因，crylA(b)基因，bla基因、bar基因和35S cauliflower mosaic virus promoter(花椰菜马赛克病毒启动区－－译注）。以转基因爆玉米花、粟粉粥、酥饼作样品。粟粥粉和酥饼用含有不同百分率（100％，1％，0．1％，w/w)的转基因玉米粉制作。在不同熟时间从样吕提取的DNA，其平均DNA碎片长度逐渐下降，但仍能通过PCR扩增。试验的几种引物组，以Cyr 03/04表现最好，可以检测出仅含0．1％Bt-玉米DNA的熟食中的转基因DNA。     

定量检测转基因植物蛋白Cry1Ac的双抗体夹心ELISA方法建立

以典型且研究较多的抗虫CrylAc基因表达的CrylAc蛋白为检测目标,制备其单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体,在优化抗体纯化方案,获得纯化抗体的基础上,以CrylAc单克隆抗体为包被抗体,以辣根过氧化物酶标记的CrylAb单克隆抗体为检测抗体,建立了CrylAc蛋白的双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测法,并用于玉米中CrylAc蛋白含量的检测。结果显示,所建立的双抗体夹心ELISA法稳定性较好,测定变异系数在3%以内;在10 ng/mL~200 ng/mL的浓度范围内,线性回归方程为+=0768.0x0114.0y(R2=0.9989),检测限为9.49 ng/mL;对玉米样品提取液中Cry1Ac蛋白含量的测定回收率在102.5%~103%范围内。本研究所建立的双抗体夹心ELISA法为玉米中Cry1Ac蛋白的定量检测提供了有效的手段,可作为一种潜在的检测方法用于转基因产品的检验检疫中,在出入境检验检疫工作中也有较高的应用价值。     

转基因玉米Bt176品系特异性环介导等温扩增检测方法的研究

根据转基因玉米品系Bt176外源插入片段与玉米基因组序列设计和筛选品系特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,最终建立转基因玉米品系Bt176的品系特异性LAMP检测方法。对该方法进行了灵敏度、特异性和稳定性评价。评价结果表明:该方法定性检测低限为0.5%,特异性和稳定性均达到100%。      

应用PCR-ELISA技术检测转基因产品的研究

建立并优化了转基因大豆与玉米的DNA提取,CaMV35S启动子和T－NOS终止子的序列特点设计特异性引物与探针，应用PCR－ELISA检测技术，建立了转基因大豆与玉米中常用外源基因的快速检测体系，并应用于进出境产品的转基因检测实际工作中。结果表明，建立的PCR－ELISA法具有操作简便，灵敏特异，结果准确的，可对转基因大豆，玉米及其它转基因产品进行定性和定量检测。     

过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA定量检测方法的建立

建立了检测小麦过敏原醇溶蛋白的定量ELISA抗体夹心法,以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白单抗包被酶标板,HRP标记兔抗醇溶蛋白抗体作为酶标抗体,工作浓度为1∶8000,将醇溶蛋白精确配制成一定浓度的标准品,检测醇溶蛋白的含量。最佳的线性范围是19.53~5000ng/mL,R2≥0.99,定量检测限为19.53ng/mL,对应的食品样品检测限为7.81ppm。样品的回收率在93.57%~105.72%之间,实验内CV为3.07%~5.91%,实验间CV为0.26%~5.24%,仅对大麦有一定的交叉反应,可在4℃放置两周。本法准确度和精密度高,重复性和稳定性好,特异性较强,适用于食品过敏原小麦醇溶蛋白的检测。      

食品中过敏原胡桃蛋白间接竞争ELISA检测方法研究

胡桃是坚果类食品中引起过敏反应的首要食品。采用胡桃总蛋白产生的多克隆抗体,建立检测胡桃成分的间接竞争ELISA方法,并通过特异性试验和样品回收试验对该方法进行验证。结果表明:该方法对胡桃蛋白的定量检测限(LOQ,相当于IC80)为94 ng/mL;在特异性试验中,只有美洲山核桃出现交叉反应,其它植物样品均未出现交叉反应;将50~1 000 ng/mL〔相当于10~200μg/g〕的胡桃蛋白添加到小麦蛋白中,胡桃蛋白的回收率在78%~93%之间。     

ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究

以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4 EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。     

四重实时荧光PCR快速检测转基因玉米及其加工产品

本研究运用四重实时荧光聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）对转基因玉米及其深加工制品进行筛选检测。选定花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（tNOS）以及根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）为外源基因,选定编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作为玉米物种的内参照基因。设计和合成靶标基因特异性引物和多重荧光探针,经特异性、重复性、灵敏性和适用性等方法学验证建立了四重实时荧光PCR检测方法。结果表明该方法检测特异性强,重复性好,扩增效率在90%~110%,标准曲线相关系数R2≥0.99,最低检测限为每20 μL反应13个拷贝,最低定量限为每20 μL反应1.3个拷贝,其检测结果与SN/T 1204-2016标准方法检测结果一致,由于四个目标基因可以在一个反应管中进行扩增反应,且含有内源基因和外源基因,可降低试剂成本,简化操作程序,缩短检测时间,为玉米及其深加工产品转基因成分的快速检测提供参考。     

应用多重PCR技术筛选检测转Bt基因作物

Bt基因在抗虫转基因作物中广泛应用,是转基因食品筛选检测中最主要的目的基因。本研究依据核苷酸序列分析结果,将在转基因作物中常见的8种Bt基因(cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/Ac、cry1A.105、cry1Ac-M、cry2Ab、cry3A和cry3Bb)划分为cry1A、cry2A、cry3A三个组,并根据每个组的一致性序列设计了可分别检测各组Bt基因的特异性检测引物,其中cry1A组采用了简并引物,经过特异性、灵敏度等测试,建立了针对cry1A组、cry2A组和cry3A组的单一PCR检测方法。此外,通过将这三对检测引物放入同一PCR体系中,还建立了可特异检测上述3组Bt基因的三重PCR方法。结果表明,本研究建立的单一PCR和三重PCR方法均可从各类样品中准确检测出预期Bt基因成分,检测灵敏度达到0.1%。本方法特异性强、灵敏度高,在转基因成分的筛选检测中有很好的应用前景。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米59122的方法建立及测量不确定度评估

为了准确定量检测非故意扩散的转基因玉米59122,建立转基因玉米59122及产品的实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价该方法。结果显示,利用该方法只能检出转基因玉米59122;16 次重复测量含量为1%的转基因玉米59122样品,平均测量值（0.9%）接近真实值（1%）,相对误差为10%,测试回收率为90%,测量不确定度为0.002;能检测到最低含量为2 拷贝的59122分子片段;除去3 次偏离平均值较大的测量值外,13 次重复测量值的变异系数为0.05。因此,实验建立的转基因玉米59122实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度、灵敏度、精密度,较低的测量不确定度。     

转基因玉米的七重PCR鉴定方法

以玉米内源基因IVR、外源抗除草剂基因(BAR、PAT)、抗虫基因Cry1Ab、筛选基因NPTII、CaMV35S启动子和NOS终止子为检测的目的片段,分别设计了7对引物,通过研究较佳引物终浓度配比和退火温度,建立了玉米转基因成分七重PCR检测体系。结果表明,建立的七重PCR体系用于同时检测内源基因和转基因成分是可行的,检测方法效率高、稳定性好。     

利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因

市场上的转基因产品以及深加工产品越来越多,其安全性引起全世界的极大争论,很多国家的检验检疫机构相继开展了转基因产品的检测工作。本文以转基因大豆类食品为材料,以聚合酶链式反应(PCR)方法为基础,选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术,针对抗除草剂Round up Ready (RR)大豆的插入基因进行PCR检测,建立适合转基因大豆类食品的检测方法．该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符．     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品

本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%～110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。     

应用依赖解旋酶DNA扩增技术检测转基因大豆

目的：基于依赖解旋酶DNA恒温扩增（helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA）技术,建立快速检测转基因大豆的方法。方法：采用以CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS 3 种外源基因和内源基因Lectin（大豆凝集素基因）为目的片段设计4 对特异引物,建立反应体系,通过HDA方法对内源基因和3 种外源基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对结果进行同源性分析。结果：建立了转基因大豆HDA检测法,检测特异性良好,3 种外源基因的检出限为0.2%。结论：转基因大豆的HDA检测方法具有普通聚合酶链式反应的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,极适合基层实验室使用,具有广阔的应用前景。     

玉米及其制品中转基因成分的单一 PCR及多重PCR检测

采用CTAB法提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分如花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶甚因（nos）终止子、根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因、吸水链霉菌（Treptomyces hygroscopicus）bar基因及苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）crylA（b）基因，筛选到阳性样品，并建立了几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法。结果表明，建立的多重PCR方法用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的，值得推广；虽然我国还未有己获准商品化生产的转基因玉米，但国外转基因玉米已流入福建省。