一株酿酒酵母的特征区域序列扩增标记

以23株不同来源的酿酒酵母为研究对象,分别提取基因组DNA,试用50条随机引物对其进行随机扩增多态性DNA分析,筛选到两条具有菌株鉴别能力的随机引物。P09可以从2.412,ST—01,SK—26,ZD—01四株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为433bp的Sc—433片断Sc—433;P46可以从2.1882,ST—01,NJ—02三株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为665bp的Sc—665片断,其中仅有目的菌株ST—01能稳定的扩增出这2个标记。把这2个片断分别克隆到pUCmT质粒载体中,经过酶切鉴定后测序,根据序列设计特异性引物,把RAPD标记转化为特征区域序列扩增标记,为酿酒酵母菌株的分子鉴别提供了新的借鉴。     

克罗诺杆菌的随机多态性扩增DNA(RAPD)基因分型研究

研究了克罗诺杆菌标准菌株和样品中分离菌株的分子特征,为克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源提供一种有效手段。采用随机引物扩增多态性DNA分析对38株菌株进行基因分型。筛选出1条随机引物,每一菌株可扩增出1～7条DNA片段,片段在400-3500bp,可将8株标准菌株的种间区分开来。以相似性50%为标准,38株克罗诺杆菌按照其遗传差异可以分为8个基因型类群。所建立的RAPD技术可用于克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源研究。     

中国猴头菇栽培菌株的系统进化研究

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)标记对7 个猴头菇之间的亲缘关系进行研究,获得了猴头菇不同菌株的DNA 指纹图谱。结果显示：14 个随机引物中有3 个随机引物的扩增产物的DNA 条带表现出明显的多态性。这3个引物共扩增出44 条带,其中36 条为多态性条带,多态性位点比率为81.81%。同时利用NTSYSpc 2.1 生物软件分析7 个供试菌株之间的遗传相似性,并绘制系统进化树。     

木霉的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对18个木霉菌株进行基因组DNA多态性分析.扩增结果表明,18个引物均反映出18个菌株间的遗传多态性,供试18个木霉菌株的RAPD分析与其生防效果之间不存在相关性.引物OPA-04与OPA-13对木霉菌全基因组DNA具有特征性分子标记.聚类分析结果表明,种间的聚类分析结果与形态鉴定的结果趋于一致.以欧氏距离5.0～5.5为适宜的阀值范围,RAPD遗传标记木霉菌可以作为该菌分类的有效手段之一.     

低双乙酰酿酒酵母的DNA标记研究

对15株酿酒酵母菌株的外观发酵度、双乙酰生成和还原能力进行了比较,通过随机扩增多态性DNA(RAPD)和HSP150编码基因的长度多态性对不同酿酒酵母菌株的基因组DNA分子差异进行了分析。结果显示,菌株YZU-APK和SS-05的外观发酵度分别为77.2%和76.8%,双乙酰峰值分别为0.26mg/L和0.25mg/L,并在发酵第8d均降至0.09 mg/L。在46条随机引物中筛选出的2条引物P07和P42能够扩增出具有较好多态性的RAPD指纹图谱,可以将15个酵母菌株分成9个遗传型;对细胞壁热休克蛋白HSP150编码基因的PCR扩增,并根据扩增条带长度的不同可以将15株酵母分成6个遗传型。综合2种分析结果,并对低双乙酰酿酒酵母菌株YZU-APK和SS-05进行DNA分子标记,确定了其基因型分别是(P07:1,P42:1,hsp150:1)和(P07:1,P42:5,hsp150:2)。     

随机扩增多态性法分析西藏牦牛奶酪中乳酸菌的遗传多样性

目的：利用随机扩增多态性（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）法对西藏地区牦牛奶酪中27 株乳酸菌基因型进行同源性分析。方法：利用5 个随机引物对Mg2+浓度、dNTP用量、退火温度、模版用量/引物用量（ng/pmol）4 个条件做单因素梯度试验,建立最佳反应条件,筛选最佳引物,然后对27 株乳酸菌和4 株乳酸菌标准菌株进行随机扩增,用NTsys 2.10e软件对扩增条带进行聚类和遗传相似性系数分析,分析结果与16S rRNA测序得到的菌种鉴定结果进行对比。结果：31 株菌遗传相似系数在0.72～1.00之间,当相似性系数在0.82时,菌株被分成了8 组,菌株按照不同种属聚类,聚类结果同16S rRNA测序结果基本一致,同时成功将Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei两个亚种区分开。结论：RAPD技术可以较好地应用于西藏地区牦牛奶酪中乳酸菌亲缘性关系分析。     

十个白灵菇栽培菌株的遗传多样性分析

本研究采用RAPD 技术对10 个不同的白灵菇株系进行遗传多样性分析。经过筛选得到的4 种随机引物共扩增出52 条DNA 片段,其中多态性条带44 条,多态性位点频率为84.6%,说明通过RAPD 扩增获得的白灵菇10个株系的遗传指纹图谱多样性丰富。利用Popgen32 生物学软件计算各株系间遗传距离并构建系统进化树,在分子水平上确定了10 个白灵菇株系间的亲缘关系,可为进行更科学、准确分类提供参考依据。     

白平菇不同菌株菌丝体的RAPD分析及系统进化关系的研究

本研究采用RAPD技术分析白平菇四个不同株系的DNA序列多态性,用15个随机引物对菌株基因组DNA进行PCR扩增,其中3个引物可以扩增出较好的多态性条带图谱,共产生66条清晰稳定的带。通过对供试菌株遗传相似系数的计算和系统聚类分析,构建了树状聚类图谱,在分子水平上分析了白平菇的种质遗传学差异,为白平菇菌株鉴定提供快速有效的技术和方法。     

RAPD在灰平菇菌株亲缘关系研究中的应用

采用RAPD技术分析了5个不同来源的灰平菇栽培菌株的DNA多态性。筛选出的8条随机引物共扩增得到107条带,其中多态性片段为69条,多态性比率为64.4%,说明收集到的灰平菇菌株具有一定的遗传多样性,它们之间存在一定的遗传差异。进一步聚类分析结果显示,当相性达到0.470的水平时,5个菌株聚成2组,第1组为1号(PL-72)、2号(PL-2)、3号(烟平2106)、4号(PL-A2);第2组为5号(PL-AD28)。当相似性达到0.570的水平时,第1组又被分为两个亚组,1号和3号菌株聚为一个亚组,而2号和4号菌株聚为一个亚组。本研究为灰平菇优良品种选育和亲缘关系的研究提供分子生物学依据。     

双孢蘑菇RAPD标记的遗传多样性分析

随机抽取108个随机引物对40个双孢蘑菇栽培菌株的DNA进行RAPD-PCR扩增实验,发现有71个随机引物能够扩增出清晰的、稳定的、具有多态性的RAPD条带。结果表明,71个随机引物共扩增出567条DNA带,平均每个引物扩增出7.99条DNA带,其中434条DNA带具有多态性,占总数的76.5%。基于RAPD-PCR扩增资料,采用欧氏距离平方系数和组间连接法,应用SPSS 11.0软件进行聚类分析,探讨40个品种间的亲缘关系与类群划分。当取欧氏距离平方系数阈值为20.5时,所有品种分为三大类;当取欧氏距离平方系数阈值取8.5时,40种双孢蘑菇菌株可被分为6个类群,此结果与双孢蘑菇菌株群的同工酶分类研究结果相当吻合。     

啤酒酵母突变株发酵性能比较及随机扩增多态DNA分析

对9株啤酒酵母菌种及经过诱变获得的突变株进行了发酵试验，比较了不同菌株的发酵能力、产高级醇能力、双乙酰还原能力以及菌株稳定性。同时利用随机引物对不同啤酒酵母株的基因组DNA进行了随机扩增多态DNA（RAPD）分析，比较不同突变株之间基因组的分子差异。结果表明：不同酵母发酵14d后外观发酵度在72．3％-76．8％，其中酵母YZB具有较高的发酵能力，最终发酵产物的高级醇含量最低，双乙酰峰值最低为0．36mg／L，而酵母Y1110最终发酵产物的高级醇含量最低为67．4mg／L，但双乙酰峰值达0．41mg／L，后酵结束后这2株酵母的双乙酰均可降至0．1mg／L以下。菌株稳定性实验结果表明，在传代7次以后和第1代的主要性能没有明显变化。利用随机引物OPG-5对不同酵母的基因组进行RAPD分析，酵母Y1110、YZB和YZD可以通过特异的扩增谱带区别于其它菌株，该结果为啤酒酵母特异的分子标记奠定了基础。     

Diversity of Listeria monocytogenes isolates from cold-smoked salmon produced in different smokehouses as assessed by Random Amplified Polymorphic DNA analyses

One hundred and forty-eight Listeria monocytogenes isolates originating from vacuum packed cold-smoked salmon produced in 10 different Danish smokehouses were compared by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) profiling. A total of 16 different reproducible RAPD profiles were obtained using a standardised RAPD analysis by four primers separately. The grouping of the 148 strains was exactly the same for the four primers used. For a sub-set of 20 strains typed by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), only one strain was allocated into a different group as compared to the grouping by RAPD typing. Different RAPD types dominated in products from different smokehouses. Some identical RAPD types were isolated in several smokehouses. In each of four smokehouses, one particular RAPD type could be repeatedly isolated from products. Each smokehouse/product carried its own specific RAPD type and this may indicate a possible persistence of closely related strains of L. monocytogenes in smokehouses.     

Analysis of the genetic variability in the species of the Saccharomyces sensu stricto complex

Random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR) analysis was applied to differentiate the sibling species Saccharomyces bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus and S. pastorianus, which constitute the most common strains of the Saccharomyces sensu stricto complex. Six decamer primers of arbitrary sequences were used to amplify the DNA of 58 strains. Species-specific (diagnostic) bands were obtained for each species. Two phylogenetic trees constructed by the neighbour-joining and maximum parsimony methods clearly showed that the delimitation of these related yeast species is possible by using RAPD analysis. Four groups of strains, corresponding to the species S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus and S. pastorianus, were obtained. Within the S. bayanus taxon, two groups of strains were observed. One includes the former type strain of S. uvarum, CECT1969(T), and closely related wine strains (S. bayanus var. uvarum), whilst the other contains S. bayanus type strain CECT1941(T) and strains CECT1991 and 10513 (S. bayanus var. bayanus). The heterogeneous S. paradoxus group was divided into three lineages, corresponding to different geographic origin, American, Japanese and European populations. In addition, due to the multilocus nature of the RAPD-PCR marker, this method is both useful and appropriate for the identification of the hybrid origin of S. pastorianus. The hybrid nature was deduced from the analysis of the fraction of bands shared by each hybrid strain and the parental species. Among the 58 strains analysed, six S. pastorianus strains were hybrids, although the fraction of genome coming from each parent varied depending on the strain.     

烟草黑胫病菌全基因组DNA遗传多态性RAPD标记

应用ＲＡＰＤ分子标记技术,从８０个随机引物中筛选出１０个分别为ＯＰＡ０２、ＯＰＡ０１３、ＯＰＡ０１４、ＯＰＡ０１６、ＯＰＡ０１８、ＯＰＢ０４、ＯＰＢ０５、ＯＰＤ０２、ＯＰＤ０３、ＯＰＤ０１１,对来自云南省６大主产烟区的２４个烟草黑胫病菌株全基因组ＤＮＡ进行随机扩增。结果表明：１０个引物共标记出８９条ＲＡＰＤ图带,其中多态性图带６３条,多态率７０．７％。引物ＯＰＤ０１１、ＯＰＤ０２、ＯＰＡ０１６、ＯＰＢ０４对每个受试样品均可标记出分子量为０．８７Ｋｂ和１．１Ｋｂ的ＤＮＡ片段,此４个引物对受试样品全基因组ＤＮＡ具有特征性分子标记的特性,利用核酸分子杂交技术对田间寄主体内的黑胫病菌的有无进行分子检测。被标记出的分子量为０．８７Ｋｂ和１．１Ｋｂ的特征性ＤＮＡ片段,可用来制备特异性探针,对田间烟草黑胫病菌发生动态进行检测和预报。     

草菇有性世代间rDNA序列变异分析及RAPD分析

草菇的遗传与有性生殖过程存在很多的特殊性和不确定性,本研究以草菇V23菌株的成熟子实体弹射孢子,单孢分离后得13个单株,分别摇瓶培养、收集菌丝,提取总DNA,用通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增后连接、转化并测序,将单孢间和单孢与亲本间的ITS序列进行比对,分析草菇ITS序列多样性及变异性;同时以相应单孢菌株DNA为模板,用20条随机引物进行RAPD扩增。结果表明:草菇单孢间和单孢与亲本间的ITS序列相似度均在99%以上,相较于亲本的ITS序列,单孢序列中发现了有5个位点出现碱基转换,但没有两个以上的单孢发生同一转换;20条随机引物分别与14个样本进行RAPD扩增,其中3个引物出现多态性条带,带型结果发现单孢菌株间的带型差异呈现一定规律。草菇ITS序列变异较少,不适于单孢间的变异分析,而RAPD方法对摸索草菇有性世代间的遗传分离规律有重要价值。     

23 株酿酒酵母ISSR指纹图谱分析及SCAR标记的建立

目的：构建酿酒酵母菌株的简单重复序列间多态性指纹图谱数据库并建立序列特异性扩增区（sequencecharacterized amplified region,SCAR）标记技术,为酿酒酵母菌株的分类、遗传亲缘关系鉴定及菌种专利保护提供可靠的DNA分子标记技术依据。方法：在简单重复序列间多态性（inter-simple sequence repeat,ISSR）指纹数据分析基础上进行聚类分析并对菌种进行分类鉴定,同时将酿酒酵母菌株9号和15号中扩增获得的ISSR特异性DNA带转化为可以直接用于菌株快速鉴定的SCAR分子标记。结果：构建23 株酿酒酵母的ISSR指纹图谱,并在相似系数为0.85水平上将23 个供试菌株分为3大类,其中,1、2、4、7、15、16、17、19、20、21、23聚为第一类;10、11、12、13、14、18号菌株聚为第二类且10号和11号菌为同一菌株;3、5、6、8、9、22号菌聚为第三类且属于同一菌株。此外,利用所获得的2 个特异性条带成功转化为序列特异性扩增区分子标记。结论：在生产上酿酒酵母菌株遗传背景差异不大,常存在同物异名现象,而采用ISSR指纹及其SCAR分子标记技术快速鉴定酿酒酵母菌株在工业生产上具有重要意义。     

PCR‐Based Differentiation and Homology of Brewing and Type Strains of the Genus Saccharomyces

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns of PCR‐amplified ribosomal RNA gene fragments (rDNA) and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) were applied for the analysis of 15 brewing and 6 related yeast strains of the genus Saccharomyces. One five‐base (ScrFI) and two four‐base cutting (HaeIII, MspI) restriction enzymes were used. The primers 21 and M13 core sequence were selected for RAPD analysis. PCR‐RFLP rDNA analysis with HaeIII, ScrFI and MspI differentiated the strains tested into four, five and four types of patterns, respectively and the analyses of the profiles showed 100% homology, between the yeast strains. One strain was an exception. Homological groups were observed for strains used in breweries globally, from a local production strain and from the isolates identified as S. cerevisiae. Using RAPD analysis, and according to discrete differences in the profiles, it was possible to divide twenty one strains into 15 and 20 groups with primer 21 and M13 respectively. RFLP‐PCR rDNA analysis was used to show similarities in closely related brewing strains, while RAPD analysis was used for differentiation of strains.