重组大肠杆菌产腈水合酶的发酵工艺研究

目前主要通过生物发酵制备腈水合酶催化3-氰基吡啶合成烟酰胺,但在反应过程中,发酵酶活低并且催化过程中极易生成副产物烟酸,因此通过自主构建的产腈水合酶重组大肠杆菌M910001-pMh1229,对其发酵条件进行了系统研究,采用单因素法对发酵过程中培养基进行优化。通过氮源、碳源的筛选,确定最优的碳氮源、诱导剂浓度。优化后的培养基对该菌发酵产腈水合酶酶活可以达到8 653U/mL,OD600达到了210,酶活对比优化前提高了45%。     

腈水合酶生产菌株产酶条件的优化

本文进行腈水合酶产酶条件的优化,对产酶影响较大的三个组分酵母膏、尿素和味精进行单因素试验,然后进6行正交试验确定最佳的培养基配比,在此基础上研究pH对发酵产酶及酶促反应的影响,确定最适的pH条件。试验结果表明,对酶活影响最大的因素是尿素,最佳的培养基配比为酵母膏12g/L,味精4.4g/L,尿素16g/L;通过流加NaOH和调节磷酸盐配比控制发酵过程pH在7.0左右,可以显著提高腈水合酶的产量;K_2HPO_4·3H_2O添加量4.0g/L,KH_2PO_41.0g/L条件下所得的腈水合酶,在多批次酶促反应试验中更稳定,实际使用效果更好。     

Nocardia sp.腈水合酶的纯化过程研究

对Nocardiasp.高活力腈水合酶进行了纯化研究。在细胞破碎中,超声时间对腈水合酶比酶活存在一个最优值,超声时间为20.00min时得到的比酶活最高。在离子交换层析过程中,采用DEAE-Sepharose作为层析介质,分别对平衡缓冲液pH、离子强度和线性梯度洗脱体积进行了优化。结果表明,采用pH7.20、50mmolL-1的Na2HPO4-NaH2PO4溶液作为平衡缓冲液,0.00~1.00molL-1的NaCl线性梯度洗脱,洗脱体积为20~25倍柱体积,此条件下腈水合酶的纯化倍数和酶活收率较佳。以Phenyl-SepharoseFF为层析介质研究了疏水层析精制腈水合酶的工艺过程,采用两步层析优化方法纯化出的Nocardiasp.腈水合酶比酶活达到2648.0U穖g-1,酶活收率为40.84%,用SDS-PAGE检测其纯度为99.00%以上。Nocardiasp.腈水合酶的两个亚基分子量分别为22.90kDa和27.38kDa。     

腈水合酶生产菌工业发酵技术研究

研究了腈水合酶生产茵的培养基组成、灭菌操作、种子质量控制以及pH值控制等方面对工业发酵的影响,培养基各主要成分的最佳含量为：氯化钴16×10^-6,尿素0．90％,酵母膏0．70％,味精0．85％,葡萄糖2．2％,确定了科学的灭菌操作方法、种子质量控制方法以及pH值调控方法,并在生产实际应用中取得了显著效果,发酵周期可缩短20h以上,酶活提高40％以上。     

生物法生产丙烯酰胺过程中腈水合酶的抑制和失活

为改进生物法生产丙烯酰胺工艺,研究了腈水合酶催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺过程中影响腈水合酶反应速率和酶失活的因素. 实验证明,水合过程中体系pH值的变化基本不影响酶反应速率;底物丙烯腈的浓度低于10 g/L时,酶反应速率与底物浓度成正比,大于75 g/L后,对酶有抑制作用;产物丙烯酰胺显著抑制腈水合酶的活性;菌体细胞内可能存在可以稳定腈水合酶的物质,胞内的腈水合酶在40℃下的半衰期可以达到59.9 h;丙烯酰胺与温度的协同作用是腈水合酶失活的重要原因.     

产腈水合酶菌株的驯化研究

以Nocardia sp. LNSY0611为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养,得到一株酶活为72.5 U·mg-1的腈水合酶高活力菌株Nocardia sp. LNSY0611XH,酶活比出发菌株提高了15倍.初步确定驯化最优条件为:葡萄糖20 g·L-1、诱导剂脲0.06 g·L-1、Co2 0.3 g·L-1、丙烯酰胺10%、温度30℃及pH 7.在此条件下,腈水合酶可高效表达.     

2,2-二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育及突变株产酶条件研究

离子注入技术被广泛应用于微生物的品种改良.利用N 离子注入法对本实验室筛选并保藏的产2,2-二甲基环丙腈水合酶菌种Pseudomonas sp.ZJUT0509进行选育,以提高2,2-二甲基环丙甲酰胺的产量,为进一步的手性拆分提供更多的原料.结果表明,氮离子注入诱变Pseudomonas sp.ZJUT0509的存活率曲线符合离子注入诱变的"马鞍型"特征曲线.通过离子注入获得的突变株的腈水合酶活性有显著提高,其中突变株F60-4的酶活达30.1 U·mL-1,约为原始菌株的9倍.对突变株F60-4进行产酶条件的优化考察,获得了培养条件.F60-4菌株产酶的最佳碳源是葡萄糖(2 g·L-1),最佳氮源是酵母粉(10 g·L-1),最适初始pH值为6.5,最适发酵温度为20℃,最佳诱导剂为1.0g·L-1的己内酰胺.与原始菌株Pseudomonas sp.ZJUT0509相比,突变株F60-4对有机氮源的利用率更高.最佳诱导剂由己内酰胺代替了原来的2,2-二甲基环丙甲腈,使实验操作简便.突变株F60-4的发酵周期为36 h,比原始菌株缩短了12 h.     

Rhodococcus boritolerans FW815腈水合酶分离纯化及其酶学性质研究

Rhodococcus boritolerans FW815具有高效水合2,2-二甲基环丙甲腈活性,利用蛋白质柱层析技术从中分离得到R.boritolerans FW815腈水合酶。实验结果表明,该腈水合酶分子量为40 kDa,由大小分别为24 kDa、22 kDa两种亚基构成。R.boritolerans FW815腈水合酶最适作用温度为37℃,最适作用pH值7.0。Cu2+、Zn2+、Ni2+等金属离子及EDTA对该腈水合酶有较强的抑制作用。除2,2-二甲基环丙甲腈、2-氨基-2,3-二甲基丁腈之外,R.boritolerans FW815腈水合酶对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈、丙烯腈、2-氨基-4-甲硫基丁腈也表现出腈水合酶活性。     

微生物法生产丙烯酰胺的生物催化剂——腈水合酶研究进展

回顾了近年来国内外在微生物法生产丙烯酰胺的生物催化剂腈水合酶的结构、催化机理、光活性、热稳定性等方面的研究进展 .腈水合酶的活性部位含有螯合的金属离子作为辅助因子 ;结合金属离子的活性中心在腈水合酶的催化反应中起着重要的作用 ;其中铁型腈水合酶具有光活性 ,其活性是通过NO调节的 :在非活性腈水合酶的铁中心上连有一个内生的NO分子 ,在光的作用下 ,NO释放出来 ,使酶的活性恢复 .进一步探讨了温度对不同菌株酶活稳定性以及氨基化合物等因素对酶活性的影响 ,并对研究的发展方向提出了一些设想     

枯草芽孢杆菌产烟酰胺酶的发酵工艺条件优化

对已筛选出的菌株枯草芽孢杆菌N-17进行发酵条件优化,利用单因素实验方法,对烟酰胺酶的发酵培养基的组分及发酵条件进行优化,确定了各因素的最适值.结果表明:该菌株在温度28℃,起始pH值7.0,己内酰胺浓度为0.2％,葡萄糖1.2％,酵母粉0.6％,Mg2+0.02％时,产烟酰胺酶活性最大,酶活比之前提升了213.8％.     

发酵生产环氧琥珀酸水解酶的研究

诺卡氏菌环氧琥珀酸水解酶是胞内酶,提高发酵过程酶的产量可以从提高菌体质量浓度和提高比酶活两方面入手。菌体质量浓度和培养基中葡萄糖的质量浓度有关,但葡萄糖质量浓度过高对菌体的生长会有抑制作用,培养基中初始葡萄糖质量浓度为5g/L,在消耗殆尽后以1.3g/(L·h)的速度流加,可以将菌体质量浓度提高到6g/L以上。环氧琥珀酸采用两段式流加,流加结束时比酶活达到3000u/g以上,菌体质量浓度达到了8g/L,与原产酶水平1200u/g和菌体质量浓度4g/L相比有较大的提高。     

蛋白聚糖类生物絮凝剂REA-11的发酵和絮凝条件

在考察絮凝剂产生菌诺卡氏菌Nocardia sp. CCTCC M201005基本生长代谢特性的基础上，研究了营养条件对生物絮凝剂REA-11合成的影响. 结果表明，蔗糖是该菌生长及REA-11合成的最佳碳源；玉米浆既能刺激菌体生长，又能显著提高絮凝剂的水平；培养基碳氮摩尔比在20~30时，絮凝活性最大. 提出了促进REA-11合成的控制策略：发酵前期适当提高玉米浆的浓度，发酵后期按碳氮比为20~30，补加一定量的蔗糖和尿素. 絮凝条件研究结果表明，REA-11在偏酸性范围内(pH=3.0~6.5)絮凝活性耐热性较强; CaCl2能显著提高REA-11的絮凝活性；本实验体系中，CaCl2的最佳助凝浓度为8 mmol/L, CaCl2浓度增大使REA-11的最适投加量呈降低趋势.     

Strategies of pH control and glucose‐fed batch fermentation for production of succinic acid by Actinobacillus succinogenes CGMCC1593

BACKGROUND: Succinic acid is an important precursor of numerous products, including pharmaceuticals, feed additives, green solvents, and biodegradable polymers. In this work, strategies of pH control and glucose‐fed batch fermentation for producing succinic acid using Actinobacillus succinogenes CGMCC1593 were carefully optimized. RESULTS: The production of succinic acid was stable within the pH range 6.0–7.2. Both cell growth and succinic acid production were inhibited by high concentrations of sodium and calcium ions, while there was no significant inhibition by magnesium ions. With an initial glucose concentration of 25 g L^?1, and glucose concentration was maintained between 10 and 15 g L^?1 during the course of fed batch fermentation, succinic acid concentration, productivity and yield were 60.2 g L^?1, 1.3 g L^?1 h^?1 and 75.1%, respectively. CONCLUSION: Of all the neutralization reagents used for pH control of A. succinogenes CGMCC1593, solid MgCO₃ was the most satisfactory. With increase of initial glucose concentration, the time course showed a longer growth lag period and the maximum biomass declined, while more carbon was diverted to succinate synthesis. The results obtained in this study should be helpful for the design of a highly efficient succinic acid production process. Copyright © 2008 Society of Chemical Industry     

基于发酵动力学模型的小球藻高密度发酵培养

构建了50 L发酵罐小球藻分批培养动力学模型,采用补料策略高密度发酵培养小球藻,考察了补料发酵过程中碳源的利用情况,采用实时荧光定量PCR技术分析了蛋白质合成关键酶二氨基庚二酸异构酶(dapF)、柠檬酸合成酶(CS)和葡萄糖?6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的基因表达情况. 结果表明,小球藻经补料培养120 h,细胞生物量达106.65 g/L,平均生长速率为0.89 g/(L?h),葡萄糖的细胞得率为0.56 g/g,发酵过程中葡萄糖和尿素浓度对小球藻的dspF, CS和G6PDH基因表达量有重要影响.     

极端条件驯化法提高腈水合酶产生菌的丙烯酰胺耐受性

为了提高产腈水合酶的菌体Nocardia sp.对催化产物丙烯酰胺的耐受性,利用极端条件改造了现有的丙烯酰胺生产菌株RS,通过向发酵液间歇加入丙烯腈催化生成丙烯酰胺,为菌体制造出一个极端环境,使菌体在生长催化过程中逐渐适应高浓度丙烯酰胺,强化其丙烯酰胺耐受性,驯化得到了RS-1菌株. 研究了驯化过程中菌体存活率、比死亡速率和腈水合酶活性随丙烯酰胺浓度的变化. 在不同的丙烯酰胺初始浓度(0~400 g/L)下比较了两菌株的丙烯酰胺耐受性,RS-1菌体催化丙烯腈水合的速率都大于RS菌体,平均提高30.8%;而且RS-1菌株的胞内腈水合酶也具有较好的丙烯酰胺耐受性. 在相同的水合条件下,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度和丙烯腈转化率分别为587.1 g/L和99.97%,都明显优于RS菌株的水合结果. 在进一步的水合实验中,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度达到了641.4 g/L.     

Nocardia sp.高丙烯酰胺耐受性菌株及水合结晶工艺

在极端条件下改造了现有的丙烯酰胺生产菌株Nocardia sp.RS,通过向发酵液中间歇加入丙烯腈催化生成丙烯酰胺而形成极端环境,将菌体生长、酶催化和菌种筛选这3个过程耦合在一起.研究了极端条件下菌体存活率、腈水合酶活性随丙烯酰胺浓度的变化.驯化得到的RS-1菌株有很好的丙烯酰胺耐受性,摇瓶水合的丙烯酰胺终浓度达到了587 g•L^-1,比RS菌株提高30.6％.利用RS-1菌株在小型反应器规模上实现了高浓度丙烯酰胺的制备,累积浓度达到了535 g•L^-1,不需浓缩即可满足市场对丙烯酰胺水溶液产品的浓度要求.在此基础上,设计了水合结晶改进工艺,预计可比现有工艺降低浓缩能耗32.8％.     

麦角固醇发酵不同流加方式的比较

研究了不同流加操作条件对实验用酵母菌的生物量和麦角固醇含量的影响,以提高麦角固醇的发酵水平.比较了恒速流加、恒残糖反馈流加、指数流加、控制溶氧的指数流加、脉冲流加、控制溶氧的脉冲流加等流加条件下pH值、溶氧、残糖浓度、生物量、麦角固醇含量等参数的变化,对相应的变化进行了讨论.结果表明,控制溶氧的脉冲式流加是一种较好的流加方式,与传统的发酵操作相比每升发酵液的麦角固醇产量提高了20％.     

温度对产甘油假丝酵母产甘油发酵过程的影响

研究了温度对产甘油假丝酵母分批发酵生产甘油及其生长动力学的影响。结果表明:在温度为28—36℃时,由于发酵周期随温度升高而显著缩短,导致细胞生长、甘油合成和葡萄糖消耗的比速率也随温度升高逐渐增加;当温度为32℃时最适于产甘油假丝酵母合成甘油,甘油产量、得率和产率分别达到120.3 g/L,0.523 g/g,1.43 g/(L.h);应用Logistic方程对细胞生长动力学进行了模拟,获得不同温度下的生长动力学参数;根据细胞生长动力学参数,得到28—36℃时甘油分批发酵过程中细胞质量浓度同温度、时间之间的一般关系式,经验证该模型在28—36℃范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况。     

The theory of fed batch culture with reference to the penicillin fermentation

A batch culture of microbes fed continuously with culture medium is described as a “fed batch culture”. When a portion of a “fed batch culture” is withdrawn at intervals the system is described as a “repeated fed batch culture”. A fed batch culture may reach a “quasi-steady state” in which the specific growth rate (μh^?1) virtually = the dilution rate, that is, the ratio of medium flow rate to culture volume. In a quasi-steady state the specific growth rate gradually decreases. A unique feature of a fed batch culture is that it allows continuous reproduction of the transient conditions between two specific growth rates, which can be chosen at will. Fed batch culture may be used to determine the relation between specific growth rate and the growth-limiting substrate concentration and to determine the maintenance energy. Simple relations are derived to enable the concentrations of products to be predicted. The effects of different cycle times in repeated fed batch culture applied to the pencillin fermentation are discussed. Repeated fed batch culture should find a major application in the production of secondary metabolites which often are synthesised at maximum rates only transiently.