一株联产L-精氨酸和聚羟基丁酸酯的重组钝齿棒杆菌的构建

Corynebacterium crenatum SYPA 5-5是一株用于L-精氨酸(Arg)生产的工业菌株。聚羟基丁酸酯(PHB)是在细菌内部形成的聚合物,将PHB代谢途径引入细胞内可影响胞内的全局代谢网络,实现联产PHB和相关化工产品如琥珀酸、L-谷氨酸和L-色氨酸等。采用基因工程技术,将来源于Ralstonia eutropha H16的PHB合成基因簇phb CAB导入到L-精氨酸生产菌株C.crenatum SYPA 5-5中,进行组成型表达,旨在获胞内产PHB、胞外产L-精氨酸的效果,对出发菌和重组菌分别进行5 L容积发酵罐实验,并对发酵相关参数进行测定分析。结果表明,由于PHB合成基因簇的导入,重组菌中PHB质量为细胞干质量的12.8%,实现了胞外产L-精氨酸、胞内产PHB的效果,并发现胞内PHB的积累对菌体生产L-精氨酸有一定的正向作用,发酵96 h,L-精氨酸的产量达到43.21 g/L,相比于出发菌提高了20%。     

精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。     

精氨酸对Escherichia coli发酵生产L-色氨酸的影响

色氨酸是人和动物体内必须氨基酸,在食品、饲料及医药工业中具有广泛应用价值.以色氨酸生产菌株Escherichia coli TRTH为出发菌株,在培养基中添加精氨酸,以降低代谢副产物的积累量,提高L-色氨酸的产量.在30 L发酵罐上考察了精氨酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明:添加0.2 g/L的精氨酸时,菌体生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率分别为41.5 g/L,34.5 g/L和18.0％,较未添加时分别提高了5.46％,5.83％和2.86％,且乙酸积累量较未添加时降低了10.99％.     

L-精氨酸生产菌的诱变育种研究

实验采用亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌(Coynebacterumglutamicum)进行诱变处理,以添加了L-精氨酸结构类似物磺胺胍的筛选平板,筛选黄胺胍抗性突变菌株,将突变菌株进行摇瓶发酵实验,选育出1株L-精氨酸产量较高和产酸性能比较稳定的突变菌株,该菌株L-精氨酸产量比出发菌株提高了56.7%。     

谷氨酸棒杆菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途径关键酶的过表达对L-精氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中与精氨酸合成相关的酶主要是由2个操纵子基因簇argCJBDFR和argGH编码合成。此外,在L-精氨酸合成途径的前体物谷氨酸和氨甲酰磷酸的合成中,由gdh、icd、gltA、carAB 4个基因分别编码的谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合酶、氨甲酰磷酸合成酶是谷氨酸和氨甲酰磷酸合成的关键酶。研究以解除了L-精氨酸的别构抑制作用的谷氨酸棒杆菌为出发菌株,利用3种不同抗性的表达质粒分别对这些关键酶的编码基因进行串联共表达。在最终得到的13个菌株中,L-精氨酸产量最高的菌株是出发菌株L-精氨酸产量的6.23倍,这表明串联过表达菌株L-精氨酸合成途径中,不同节点关键酶的编码基因可以更有效地提高菌株中L-精氨酸的产量,为进一步改造L-精氨酸的合成途径、优化L-精氨酸的产量奠定了基础。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

解除硝酸盐呼吸和氮通量限制对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

精氨酸广泛应用于食品、医药和工业领域中，其生产方式主要是微生物发酵法。钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)是精氨酸生产的重要工程菌株。该文针对课题组前期构建的钝齿棒杆菌(CCM01)进行代谢改造，探究了arnR和cgl2482的敲除对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响。采用无痕敲除方法构建工程菌株并对其进行摇瓶发酵，测定菌体生长量、L-精氨酸产量、葡萄糖消耗量考察菌株产L-精氨酸的影响。硝酸盐能提高钝齿棒杆菌在氧气不足时的生长率，并且arnR的敲除有助于L-精氨酸的生产，arnR敲除菌株CCM02较对照菌株产量提高了8.58%,且当硝酸盐浓度在1.5 mmol/L时对积累L-精氨酸最为有利，产量达到17.09 g/L;cgl2482的敲除有助于氮源流入精氨酸合成途径，其敲除菌株CCM03精氨酸产量达到了17.88 g,较对照提高了4.9%;最终在CCM03发酵中添加1 g/L的尿素、50 g/L的谷氨酸钠以及1.5 mmol/L的硝酸盐时，L-精氨酸产量达到22.25 g/L,较CCM01提高了46.8%。     

拟干酪乳杆菌全合成培养基氨基酸及维生素组分优化研究

该文在已有的乳酸发酵全合成培养基基础上，研究了氨基酸和维生素类组分对菌体生长和乳酸生成的影响。通过单组分浓度梯度实验确定了对菌体生长和乳酸合成有明显影响的6种氨基酸和3种维生素；以此作为Plackett-Burman实验设计的因素，筛选出了生物素、天冬氨酸、谷氨酸3种对于乳酸生物合成有极显著影响的因素；通过最陡爬坡实验确定3种因素具有最大响应值的浓度范围；并最终通过Box-Behnken实验得出3种因素的最佳添加浓度。在250 mL摇瓶和2.5 L发酵罐中对优化后的培养基进行验证实验，发现优化后合成培养基的乳酸产量、产率和糖酸转化率都较优化前有了显著提高。该实验研究结果为该菌株今后的代谢调控研究奠定了基础。     

吐温对钝齿棒杆菌产L-精氨酸代谢的影响

目的:以课题组构建的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT NAGK M4 △proBANcgl1221AdtsR1(CCM01)为出发菌株,探究吐温(Tween)对该菌产精氨酸代谢的影响.方法:优化精氨酸发酵及Tween质量浓度,测定菌体生长量、L-精氨酸产量、发酵液残糖量考察Tween ...     

基于代谢流量分析的L-谷氨酸发酵过程优化

目的通过构建L-谷氨酸生产菌的代谢网络,依据代谢流分析理论,得到L-谷氨酸生产菌不同发酵时期的代谢流分配;通过对节点及代谢流的分析,为发酵过程控制提供理论指导.方法测定并计算发酵中、后期L-谷氨酸等代谢物的胞外浓度和积累(或消耗)速率;应用代谢流分析方法,通过MATLAB软件线性规划得到发酵中、后期胞内代谢流分布.结果表明在L-谷氨酸发酵过程中,99.84%的葡萄糖进入糖酵解途径.41.66%的碳架进入乙醛酸循环途径,76.35%用于合成L-谷氨酸,CO2固定反应的代谢流量为32.86%与途径分析获得的理想代谢流分布相比,试验测定的CO2固定反应代谢流量偏低,合成L-谷氨酸的代谢流远低于理想代谢流(100%);采用脉冲流加补料方式,控制溶氧量5%左右,发酵液中L-谷氨酸最高产酸达141 g/L.结论根据代谢流分析结果,通过优化发酵过程控制(如流加方式、溶氧水平等)来减少副产物的生成,增强CO4固定反应.降低乙醛酸循环途径的代谢流量,从而显著提高L-谷氨酸的产率.