抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并进行鉴定。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心法对猪HEV进行纯化,免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选能稳定分泌抗HEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗进行生物学鉴定。结果筛选出4株能稳定分泌抗HEV单抗的杂交瘤细胞株2H2、2A1、1E2、4D4。经鉴定,4株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水抗HEV的ELISA效价可达1∶12800～1∶51200,其中3株HI效价可达1∶24～1∶28,另1株为0。4株杂交瘤细胞分泌的单抗与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;杂交瘤细胞染色体数为83～103;除2A1单抗为IgG2b外,其他3株均为IgG1;Westernblot分析表明,2H2、2A1和4D4能识别HEV的血凝素-酯酶蛋白(HE),1E2可识别纤突蛋白(S)。结论已成功制备出抗HEV的单克隆抗体,为HEV快速检测试剂的研制奠定了基础。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。     

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

GⅡ.4型人诺如病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法 PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过亲和层析纯化获得重组蛋白GST-VP1。利用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-VP1抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并进行纯化。采用间接ELISA法、Biacore法和Western blot法分别检测单克隆抗体的效价、亲和力及特异性。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pGEX-5X-1-VP1构建正确。重组蛋白GST-VP1相对分子质量约85 000,大部分以可溶形式存在,纯化后浓度为1.100 mg/mL。筛选获得3株能分泌GⅡ.4型HuNoV VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为NoV C1、NoV D9和NoV H6,效价均可达1∶10~7以上,亲和力常数KD(M)分别为4.422×10~(-7)、4.303×10~(-8)、7.540×10~(-7 )mol/L,均可与HuNoV VP1天然蛋白及GST-VP1重组蛋白发生特异性结合。结论利用原核表达系统成功表达了GST-VP1蛋白,并通过杂交瘤技术制备了高效价的GⅡ.4型HuNoV VP1特异性单克隆抗体,为GⅡ.4型HuNoV免疫诊断和疫苗的研发奠定了基础。     

抗人类共激活蛋白单克隆抗体的制备

目的制备抗人类共激活蛋白(CLP)单克隆抗体,并进行纯化。方法配制2×DMEM培养基,与等量的2.2%甲基纤维素溶液混合,加入HAT、胎牛血清等,配成半固体HAT选择性细胞培养基。用基因重组人CLP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS-2细胞融合后,直接在半固体培养基上克隆化培养,筛选可持续、稳定、高效分泌抗CLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对分泌的单抗进行鉴定后,制备小鼠腹水,经DEAE离子交换柱纯化,半饱和硫酸铵沉淀,G25凝胶过滤除盐。结果共筛选出14株分泌抗CLP单抗的杂交瘤细胞,其培养上清可与相对分子质量约16000的CLP抗原结合,抗体类型为鼠IgGa1型。多数克隆分泌的抗体相对亲和力大于1∶20000,14株克隆分泌的单抗分别对应3个抗原结合位点。纯化后的单抗纯度接近95%。结论已成功制备并纯化了抗人CLP单克隆抗体,为建立CLP免疫学检测方法奠定了基础。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。     

adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备

目的制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)单克隆抗体,并用其区分两亚型HBsAg。方法利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体,采用间接ELISA法进行筛选;优化鉴别试验抗原包被剂量,并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证。结果共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体7株;鉴别试验抗原的最佳包被剂量为10μg;1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adwA450/adrA450值均大于2,判定其为adw亚型;1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adrA450/adwA450值均大于2,判定其为adr亚型;3A5株单抗检测4份编盲样品的adrA450/adwA450值和adwA450/adrA450值均小于2,未能区分两亚型HBsAg。结论抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。     

羊布鲁菌O链M抗原提纯及其单克隆抗体的研制

目的研制羊布鲁菌O链M纯化抗原及其单克隆抗体。方法采用冷酚法提纯羊布鲁菌16M的O链抗原,并经琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS-PAGE鉴定,用灭活的该抗原免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并进行鉴定。结果建立3株分泌单克隆抗体的细胞株2D10、3C6和1E10,ELISA效价分别为1.380、1.109和1.048,与大肠杆菌0:157、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、鼠伤寒沙门菌和猪胸膜肺炎放线杆菌均无交叉反应。3C6和1E10与牛布鲁菌544A发生交叉反应,2D10的亲和常数达5.30×10~7M~(-1)。结论已制备出纯化的羊布鲁菌O链M抗原及其单抗。     

GⅡ.17型诺如病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.17型诺如病毒(noroviruses,No V)单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法将小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0与经GⅡ.17 No V VLPs抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过替代性的中和试验筛选出阳性杂交瘤细胞,制备单克隆抗体并进行纯化,ELISA法检测单克隆抗体效价,SDS-PAGE法检测单克隆抗体纯度,BCA法检测单克隆抗体浓度,Biacore法检测单克隆抗体亲和力,亚型试剂鉴定单克隆抗体亚型,并进行各单克隆抗体与不同型NOV VLPs-唾液人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的交叉中和试验,单抗与不同型NOV VLPs结合能力的Western blot鉴定。结果筛选出3株具有中和活性的细胞株,分别命名为E12、B7、H7,纯化后的3株单克隆抗体效价均在106以上,浓度分别为6.932、2.662和2.371 mg/ml,亲和力常数KD均为10-9 mol/L,单克隆抗体E12的纯度在93%以上,属于Ig G2a亚型,单克隆抗体B7和H7的纯度分别在98%以上,属于Ig G1亚型。3株单克隆抗体仅对GⅡ.17型No V具有中和活性,对其他型的No V无中和活性,且与8种抗原均发生结合反应,但E12对8种抗原的结合能力较B7、H7差。结论已成功制备出抗GⅡ.17 No V的单克隆抗体,为进一步研究该病毒的生物学特性及疫苗的开发奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立能稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用SARS-CoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立6株稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行全面鉴定。结果免疫双扩散证实1C6细胞株分泌的单抗为IgG2a亚类,其余5株细胞分泌的单抗为IgG1亚类;腹水效价均达到10-6以上;6株细胞分泌的单抗均不与麻疹病毒等其它5种呼吸道病毒发生交叉反应;Westernblot证实6株细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约150000的S蛋白及其相对分子质量为120000的裂解片段;相加指数证实6株细胞分泌的单抗识别相关的抗原表位;用硫氰酸铵洗脱法比较了6株细胞分泌的单抗的相对亲和力大小,依次为1A4>4F6>1C6>1B10>2H2>1F3;中和试验证实单抗4F6和1F3具有中和活性,中和效价均为1∶10;杂交瘤细胞株连续培养3个月以上及冻存半年后复苏,细胞生长良好,效价稳定。结论已获得抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断及进一步研究奠定了基础。