黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶优化发酵条件研究

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase,EC3.1.1.20),它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖.主要来源于微生物,存在于细胞内和细胞外,目前研究得较多较为深入的是青霉和黑曲霉.本实验对五倍子生料固体发酵产单宁酶进行了研究,发酵条件的单因素优化后得到:初始水分含量80%,接种量1%,20%五倍子,温度30℃为最佳产酶条件.在此基础上,利用正交实验对显著影响产单宁酶的培养基及培养条件因素进行优化,得到固体发酵黑曲霉诱变菌株最佳产单宁酶条件为:湿度80%、接种量1%、发酵温度33℃、五倍子含量15%.其中温度对黑曲霉产单宁酶酶活性的影响是显著的,并测得在此最佳发酵条件下产单宁酶活性达57.32U/gds.     

黑曲霉B0201液体发酵产单宁酶最佳工艺条件研究

目的:研究黑曲霉B0201液体发酵产单宁酶的条件。方法:用紫外分光光度法测定酶活,采用单因素法对黑曲霉B0201产单宁酶的工艺条件进行优化。结果:液体发酵主要产胞内酶,4%单宁酸、2.5%葡萄糖、1.25%(NH4)2SO4是产酶的最佳培养基;温度30℃,初始pH值为5.0,接种量孢子悬液1×108个/mL,装液量50mL,摇床转速140r/min是产酶的最佳工艺条件,发酵72h,单宁酶的活力最高,可达145.2U/mL。     

黑曲霉固态发酵橘皮生产纤维素酶及淀粉酶

以橘皮为原料,以黑曲霉AS3.3928为生产菌株,采用固态发酵法生产纤维素酶和淀粉酶。通过单因素试验考察固态发酵培养基中橘皮含量、培养基含水量、接种量及发酵时间4个因素对纤维素酶和淀粉酶活力的影响。在单因素试验基础上,通过正交试验最终确定最优产酶条件为：固态发酵培养基中添加16g橘皮,并加入5mL无菌水使培养基初始含水量为64mL/100g,黑曲霉接种量15%,发酵60h。在此发酵条件下所产纤维素酶活力可达1816U/g,淀粉酶活力达196U/g。结果表明,利用黑曲霉固态发酵橘皮,非常有利于纤维素酶和淀粉酶的生产。     

黑曲霉B1401固态发酵茶叶加工废料产单宁酶的研究

为促进茶叶加工废料的高效利用,对黑曲霉B1401利用茶叶加工废料固态发酵生产单宁酶进行初步研究。在单因素研究的基础上,运用Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面法优化黑曲霉B1401固态发酵产单宁酶的最佳工艺条件。结果表明:可溶性淀粉0.48%、氮源比(尿素∶硝酸钠)0.74∶0.26(g/g)、接种量30%、装载量5 g、液固比1.8∶1(mL/g)、发酵温度30℃、发酵时间为99 h,在此条件下单宁酶酶活力可达到46.06 U/g。验证试验值44.02 U/g与模型的预测值基本相符,表明该试验方法适合于黑曲霉B1401的固态发酵工艺。     

响应面法优化黑曲霉产单宁酶的固体发酵条件

通过固体发酵培养基单因素研究,确定了三个影响单宁酶产率的关键因素,对氮源用量、五倍子用量、培养温度采用响应面法的中心旋转实验设计原理,进行三因素三水平的响应面分析,以获得最佳产单宁酶的培养基及培养条件组成。结果表明,固体发酵黑曲霉最佳产酶条件为：五倍子含量为9％;氮源添加量为2．3％;温度为32℃。在此条件下进行发酵产酶重复实验,酶活力为219．4U／mL。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

高产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其固态发酵的研究

从自然界中采集土壤样本,使用阿魏酸乙酯为唯一碳源的选择性培养基;进行初筛、固态发酵产酶试验、复筛得到1株高产阿魏酸酯酶的菌株,通过形态学观察鉴定为黑曲霉。对该菌株固态发酵产阿魏酸酯酶的培养条件进行了研究,单因素实验结果表明,相同汽爆条件下汽爆稻草的发酵产酶酶活较高;在固液比1∶3、初始pH3、麸皮添加量25%、30℃下发酵3d后酶活最高,可达445.1mU/g。     

黑曲霉B0201产单宁酶生物转化没食子酸工艺研究

该文对微生物产单宁酶发酵五倍子合成没食子酸进行了研究.并对五倍子诱导黑曲霉产生单宁酶进行了生物转化实验研究,开展了产酶条件优化实验,对酶反应转化的最适pH值、温度、反应时间、底物浓度等进行研究,得出了最佳培养条件和微生物酶法制备没食子酸的工艺,为开发五倍子的生物化工加工技术提供参考.     

常压室温等离子体快速诱变选育单宁酶高产黑曲霉菌株

利用常压室温等离子体快速诱变技术对产单宁酶黑曲霉菌株B0201进行诱变,通过溴酚蓝平板变色圈法初筛,液态发酵产酶测定法复筛获得突变株B1401,其诱变后的菌株在液态发酵中获得17.61 U/g酶活,提高2倍;并在固态发酵中进行验证,在固态培养中获得酶活27.68 U/g,提高1.64倍。通过因素优化,得出其液态培养产酶的条件为单宁酸浓度5%,葡萄糖浓度2.5%,最适培养时间3.5 d,最适产酶生长温度28℃。     

黑曲霉固态发酵菊芋粉产菊粉酶的工艺条件优化研究

为提高菊粉酶活力,降低成本,研究了黑曲霉固态发酵菊芋粉产菊粉酶的发酵工艺,实验结果表明,初始pH、发酵时间和发酵温度对菊粉酶活力的影响均显著,优化后的发酵工艺参数麸皮28%,菊芋粉12%,(NH4)H2PO40.5%,玉米浆1%,按固液比4:6加水,初始pH为7.0,接种量3%,35℃培养6d,所得的菊粉酶活力最高,达158U/g,为菊粉酶的工业化生产提供了技术参考.     

黑曲霉N5-5产单宁酶的酶学性质与固定化

本实验室自主分离的黑曲霉N5-5所产单宁酶已发现对没食子酸丙酯具有良好酶解效果。为了单宁酶的工业化应用,本次研究大批量培养单宁酶,探究其对单宁酸的酶解效果及酶的固定化效果。发酵采用先液体扩培后固体发酵的形式,提酶后利用陶瓷膜过滤技术纯化、浓缩酶液,并对比冷冻干燥和喷雾干燥两种不同干燥方式,还使用树脂载体对酶进行固定化。实验表明,纯化后单宁酶酶活达258.53 U/mL,可水解10%至50%浓度的单宁酸,其中30%以下底物浓度酶解效果较好;冷冻干燥对酶活影响不大而喷雾干燥使酶活降为174.02 U/mL;另外,单宁酶通过树脂载体固定化后,在实验条件下可重复使用至少4次。研究为提高黑曲霉N5-5发酵所产单宁酶的媒介效率、降低酶解反应成本、实现商业化生产建立了理论基础。     

利用黑曲霉B1401发酵废弃茶末浸提液产单宁酶的工艺优化

以废弃茶末为原料,接种黑曲霉,以液态摇瓶的形式进行单宁酶生产的研究。通过单因素实验、Plackett-Burman实验及Box-Behnken响应面实验优化黑曲霉B1401液态发酵产单宁酶的最佳工艺条件。结果表明,诱导物为6%单宁酸+3%茶多酚,碳源为复配碳源,即0.746%可溶性淀粉:0.254%蔗糖,氮源为复配氮源,即0.3%尿素:0.7%硝酸钠,接种量为1%,装液量为90 mL/250 mL,转速为140 r·min-1,温度为30 ℃,发酵时间为72 h,此条件下单宁酶酶活可达104.82 U/g。     

利用微生物酶两步法生产没食子酸的初步研究

没食子酸及其衍生物是食品、医药等工业的一类重要原料。以黑曲霉B0201为菌种,以五倍子为原料,直接生料固体发酵法不能生成没食子酸,但是,先用生料固体发酵生产单宁酶,再用酶法制备没食子酸是可行的。研究表明,分两步制备没食子酸反应4h时,100mL单宁酶酶液中积累了0.77g没食子酸,建立了一种黑曲霉单宁酶两步法生产没食子酸的制备工艺。     

黑曲霉B0201生料发酵产单宁酶的提取及酶学性质研究

对黑曲霉B0201利用五倍子为诱导物生料发酵产胞外单宁酶的提取及酶学性质进行了研究.结果表明:硫酸铵两步沉淀的饱和度为40%和90%;该酶的最适温度为40℃,最适pH为5.0,低于60%时的热稳定性高,60℃以上迅速失活.Zn~(2+)、Mg~(2+)、吐温80、EDTA等对酶活力无明显影响,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ba~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Al~(3+)等对酶有抑制作用.以没食子酸丙酯(PG)为底物,单宁酶的米氏常数Km为0.514mmol/L,Vmax为71.8μmol/L·min.     

单宁酸酶产生菌氮离子注入的诱变效应研究

研究了单宁酸酶高产菌株的选育以及低能N+ 离子注入黑曲霉 970 1 (Aspergillusniger 970 1 )的诱变效应。实验结果表明 ,离子注入具有较高的正突变率和较大的变异幅度 ,分别为 2 7 6 1 %和 1 9 35 %～ 48 35 % ,而紫外诱变的正突变率只有 7 6 0 % ;ESR(顺磁共振 )研究表明 ,不论黑曲霉孢子是否经过离子注入 ,孢子内都存在自由基产物 ,但注入后的孢子都产生了较强的自由基波谱单一峰 ,且随注入剂量的增加 ,自由基产额也增加 ,同时 ,孢子存活率的测定结果表现出了“马鞍形”的剂量存活效应曲线 ;扫描电镜观察表明 ,未经注入的孢子较为完整 ,而经注入后的孢子则有明显的刻蚀损伤和破壁现象。剂量越大 ,损伤也越大。以离子注入能量为 1 0keV ,剂量为 3× 1 0 15 N+ /cm2 的注入条件 ,获得一株产酶活为 34 5 0mol/s的高产菌株 ,比原始菌株酶活力提高了 2 6 8倍 ,且酶活性稳定。     

交联酶聚集体法制备单宁酶及固定化酶性质研究

交联酶聚集体法(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一种新型的无载体酶固定化方法。使用该法固定化黑曲霉产单宁酶,制备无载体固定化单宁酶(Cross-linkedenzyme aggregates-tannase,CLEAs-TA),并对其制备条件、结构特征、酶学性质进行分析。结果表明,最优制备条件为单宁酶游离粗酶液在冰水浴中经80%的硫酸铵沉淀30min后,以1.5%戊二醛水溶液进行酶聚集体交联反应,可获得较高活性、较高稳定性的交联酶聚集体,酶活回收率达47.33%,对酯键水解作用的最适温度、最适pH值分别为50℃、4.5,与游离酶相比,表现更高的pH及温度稳定性,重复使用6次后,活力剩余32.86%,其良好的操作稳定性有利于没食子酸丙酯高效转化为没食子酸及广泛应用于水解茶饮料中单宁的反应。     

多菌种分步固态发酵果渣生产菌体蛋白饲料的工艺优化

实验研究了多菌种分步固态发酵果渣生产菌体蛋白饲料的工艺条件,以果渣为主要原料,麸皮、豆粕、谷糠等为辅料,通过对多菌种(黑曲霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母和酿酒酵母)接种及培养方法、菌液的接种量、发酵的最佳温度、共发酵时间、固液比及物料酸碱度因素的优化研究,获得了优化后的多菌种分步固态发酵果渣生产菌体蛋白饲料生产工艺。通过单因素试验及正交试验,确定最佳发酵条件为固液比60%,初始pH5.5,温度30℃,黑曲霉的接种量为7.50%,复合酵母液的接种量为10%,黑曲霉在发酵初期接入,复合酵母液在发酵24h后接入,共培养时间为72h。在最佳菌种配比和发酵条件下,发酵终产物的粗蛋白质含量从4.97%增加至27.60%,增长了22.63个百分点,达到优质蛋白饲料标准。