家蝇幼虫凝集素的分离纯化及其抑制MCF-7细胞活性的研究

家蝇幼虫血淋巴粗提液经过亲和层析,分离出3种与D-半乳糖特异性结合的蛋白,经高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离出分子质量为38ku的家蝇幼虫凝集素（MLL-2）,该组分具有明显的凝血活性．圆二色谱结果表明,MLL-2的二级结构主要是以／3折叠（80．3％）和无规卷曲（19．5％）的构象存在．MTT实验结果显示,MLL-2对人乳腺癌（MCF-7）细胞的生长具有明显的抑制作用,其抑制效果具有时间和浓度依赖性．形态学观察表明,MLL-2处理过的MCF-7细胞出现凋亡小体、染色质浓缩凋亡现象．经流式细胞仪分析MCF-7细胞被阻遏在G2／M期,并且凋亡率随作用时间的延长而增加．MLL-2通过诱导MCF-7细胞发生凋亡,从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用．     

E2弱化双酚A雌激素活性机制

前期研究发现天然雌激素E2可以弱化一种常见雌激素类污染物双酚A的活性,为探讨这一现象的机制,利用人体乳腺癌细胞MCF7,从细胞周期、雌激素受体途径、MAPKs信号途径进行实验．结果表明:E2可诱导DNA合成期细胞显著增高,抑制受体蛋白表达,提高ERK蛋白的表达,进而激活多种转录因子;双酚A显著抑制受体蛋白表达,对MAPKs信号通路基本没有影响,可同时提高DNA分裂期与间歇期细胞比例;两者联合后活化了受体途径和ERK途径,促进Cfos的转录表达,激活cyclin D1蛋白,增加S期及G2期细胞比例．E2弱化双酚A的可能机制为Cmyc蛋白表达下降．     

凋亡蛋白对Bcl-2家族几个基因表达影响

凋亡蛋白（Apoptin）只诱导肿瘤细胞或转化的细胞凋亡,但其作用机制还不十分清楚．从鸡贫血病毒总DNA中克隆出凋亡蛋白基因,构建pcDNA3．1／CT—Apoptin—GFP—TOPO融合表达的载体．用该载体转染HHCC单层传代细胞24h后,观察到绿色荧光蛋白表达,同时观察到细胞形态呈凋亡特征变化．提取细胞总RNA,按SuperArray芯片操作方法检测到实验组Bcl-2家族中的BimL,Bcl-2,Bax和Bak基因上调表达．Bcl-2家族在细胞凋亡的过程中作用重要．凋亡蛋白诱导HHCC细胞凋亡过程中,促凋亡的BimL,Bax和Bak基因上调,抗凋亡的Bcl-2基因也上调．可能BimL与Bcl-2竞争性结合导致Bax或Bak释放,最终诱导细胞凋亡．揭示Bcl-2家族的基因参与凋亡蛋白诱导的HHCC细胞凋亡过程．     

滇龙胆提取物对脂多糖诱导的THP-1巨噬细胞的抗炎作用

研究了滇龙胆提取物及龙胆苦苷单体对脂多糖(LPS)诱导的THP-1巨噬细胞的抗炎作用,为其药理价值的开发提供理论基础.采用体外THP-1细胞诱导的M1型巨噬细胞模型,分别加入滇龙胆粗提物和龙胆苦苷单体处理后,检测巨噬细胞中细胞因子的mRNA水平和炎症信号通路蛋白表达.研究发现,与单独LPS刺激组相比,滇龙胆粗提物和龙胆苦苷单体均可以抑制巨噬细胞部分促炎因子mRNA表达;龙胆苦苷可以抑制IκBα蛋白降解和NF-κB p65、TBK1蛋白磷酸化.滇龙胆、龙胆苦苷具有较好的抗炎活性,其可通过抑制NF-κB信号通路发挥作用.     

阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7/Adm细胞系的建立及其耐药特性

建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段之一,也是探讨肿瘤多药耐药机制及其逆转的基础。采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞,建立MCF-7/Adm耐药模型;MTT法检测耐药倍数;流式细胞术检测MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞中阿霉素的积累量;real-time PCR检测MCF-7/Adm细胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表达。结果显示,阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm细胞存活的IC50值分别为0.535μg/mL和173.275μg/mL,耐药倍数为324;MCF-7细胞中的阿霉素积累量较MCF-7/Adm明显高;MCF-7/Adm细胞中mRNA水平ABCB1基因表达明显上调,ABCG2和ABCC1基因表达下调。成功获得对阿霉素耐药的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm,为进一步研究乳腺癌多药耐药机制及其逆转提供有利工具,并且对乳腺癌化疗药物的筛选具有一定的意义。     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上，确定了分批发酵的基本培养条件．分别在B．Braun 5L自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵，针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况，改变了培养方式．比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量，得到了高产量和高表达的培养条件：在培养过程中始终保持DO值〉30％，在对数生长期溶氧供给不足的情况下，提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧；（2）限制性流加葡萄糖；（3）培养温度35℃，诱导表达温度30℃；（4）对数中期诱导，表达时间为4～5h；（5）在诱导前加入新鲜培养基，稀释发酵液一倍，并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂．最终使菌体的干重达10g／L，融合蛋白表达量达23．25％．     

阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7／Adm细胞系的建立及其耐药特性

建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段之一,也是探讨肿瘤多药耐药机制及其逆转的基础。采用大剂量间歇诱导法诱导 MCF-7细胞,建立 MCF-7/Adm耐药模型;MTT 法检测耐药倍数;流式细胞术检测MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞中阿霉素的积累量;real-time PCR检测MCF-7/Adm细胞中 A BCG2、A BCC1、A B-CB1基因的表达。结果显示,阿霉素抑制 MCF-7和 MCF-7/Adm 细胞存活的 IC50值分别为0．535μg/mL 和173.275μg/mL ,耐药倍数为324;MCF-7细胞中的阿霉素积累量较MCF-7/Adm明显高;MCF-7/Adm细胞中mR-NA水平 A BCB1基因表达明显上调,A BCG2和 A BCC1基因表达下调。成功获得对阿霉素耐药的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm ,为进一步研究乳腺癌多药耐药机制及其逆转提供有利工具,并且对乳腺癌化疗药物的筛选具有一定的意义。     

胡桃醌通过线粒体途径抑制宫颈癌Hela细胞生长的研究

胡桃醌的化学成分为5-羟基-1,4-萘二酮,是从核桃楸中分离出的重要化合物,对多种恶性肿瘤的生长具有抑制活性。研究中,子宫颈癌Hela细胞接受不同剂量的胡桃醌处理,利用MTT实验检测胡桃醌对Hela细胞的增殖抑制作用、流式细胞术检测胡桃醌对Hela细胞周期和凋亡的影响以及Western blot检测CytC、Bcl-2、Bax和caspases蛋白水平的表达。结果表明,胡桃醌可以呈剂量依赖性的方式显著抑制Hela细胞的活性。此外,膜联蛋白Annexin V-FITC在50μM和100μM浓度的早期凋亡率分别为16. 79%和30. 03%,而对照组为10. 73%。不同剂量胡桃醌处理Hela细胞后,Cytc水平和Bax/Bcl-2比值较对照组明显增高,同时caspase-3、-9的活性也明显变化。结果表明,胡桃醌可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡有效抑制Hela细胞的生长。     

瓜蒌皮抗肿瘤活性成分的初步研究

采用改进的MTS法来探究瓜蒌皮石油醚相不同极性成分对结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用,探讨其抗肿瘤活性。利用硅胶柱色谱制备极性不同的五种成分,改进的MTS法检测细胞的增殖作用,Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞周期;Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞凋亡。在低浓度情况下发现,瓜蒌皮醚相极性成分促进MCF-7细胞生长,成分E诱导细胞停滞在S-期而起到抑制癌细胞增殖的作用,并且成分C及E抗癌细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡介导的作用机制,并以剂量依赖方式诱导其细胞凋亡。通过硅胶柱色谱制备的石油醚相不同极性成分具有抗肿瘤活性。     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

Hsp90抑制剂BIIB021对人急性T细胞白血病Molt-4细胞周期和凋亡的影响

为了研究Hsp90抑制剂BIIB021对人急性T淋巴细胞白血病细胞株Moh-4增殖和凋亡的影响,采用MTT法检测了BILB021对Molt-4细胞增殖的影响,Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡形态学变化,流式细胞术检测药物作用前后细胞周期和凋亡的改变,Westernblotting检测BIIB02l对细胞周期和凋亡相关蛋白的影响。结果显示：BIIB021以时间和刺量依赖性方式抑制Molt-4细胞增殖,48、72h的IC50分别为384．6nmol／L和301．8nmol／L;Hoechst33258染色可观察到细胞内出现凋亡小体,且随着药物浓度增大,凋亡小体的数目也逐渐增多;流式结果同样显示,随着药物浓度升高,细胞凋亡率逐渐上升,400nmol／LBILB021可诱导细胞凋亡率达34．4％;另外,BIIB021可显著阻滞细胞于GO／G1期;Westernblotting显示BILB021激活Caspase-8、-9、-3和PARP,下调CDK4／6,上调p21和p18,并能明显抑制Akt和p65。由此表明,BIIB021能激活死亡受体途径和线粒体途径诱导Molt-4细胞凋亡,并通过影响CDK4／6和p21、p18使得Molt-4细胞被阻滞于GO／G1期,抑制细胞增殖;BIIB021对Mott-4的Akt和NF-kB也有抑制作用。     

水飞蓟宾对MCF-7和SK-OV-3诱导凋亡作用的不同敏感性

由于肿瘤的异质性,抗肿瘤药物作用不同的肿瘤模型时表现出不同的敏感性和不同的作用机制.将水飞蓟宾分别作用乳腺癌细胞MCF-7和卵巢癌细胞SK-OV-3,研究其对细胞增殖、细胞凋亡的影响及可能的作用机制.与卵巢癌细胞SK-OV-3相比,水飞蓟宾对乳腺癌细胞MCF-7具有明显的细胞增殖抑制及诱导凋亡能力,并都通过激活caspase 3的方式启动凋亡程序.此研究结果将为肿瘤的个体化治疗和临床实验提供可靠的保证.     

Mechanism of apoptosis of human osteosarcoma M-G63 induced by arsenic trioxide

Objective To observe the apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells induced by As2O3 and to explore its possible mechanisms. Methods The flowcytometric analysis and transmission electronmicroscope were performed to investigate the inducing apoptosis and inhibitative of As2O3 on osteosarcoma MG-63 cells. In order to study mechanism of apoptosis in MG-63 cells treated with As2 O3, microarray was performed. The down-regulated gene was confirmed by RT-PCR, Northern-blotting. Results After treated with As2O3, hypodiploid peak before G0/G1 phase was observed in MG-63 cells through FCM analysis. Loss of microvilli, condensation and fragmentation of nuclear chromatin, condensation of cytoplasmic organelles, dilatation of the endoplasmic reticulum shrinkage of cells and alterations in cell membranes and apoptosis bodies which were observed in MG-63 cells treated with As2O3 by transmission electronmicroscope. The results of microarray show that As2 O3 induced MG-63 cell apoptosis involves down-regulation of IEX-1 and the down-regulated gene is confirmed by RT-PCR and Northern-blotting.Conclusion The results show that As2 O3 selectively inhibits growth of the solid tumor MG-63 cells by triggering apoptosis and indicates MG-63 induced by As2O3 cell apoptosis may through the IEX-1 pathway.     

凋亡因子（TRAIL）对癌细胞凋亡的机制研究

凋亡因子TRAIL（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand）能诱导肿瘤和转化细胞凋亡而不伤害正常细胞.TRAIL与细胞膜上死亡受体（death receptors,DR）结合,引发受体蛋白构象变化,经胞膜内受体死亡域（death domain,DD）募集接头蛋白FADD（Fas associateddeath domain）,再经过FADD的死亡效应域（death effector domain,DED）与凋亡蛋白解酶原-8/10（procaspase-8/10）的DED相互结合,形成DISC（death-inducing signaling complex）,引起凋亡蛋白解酶（caspase）级联反应,促使癌细胞凋亡.目前,可溶性重组人性化TRAIL（rhTRAIL）和抗DR4/5单克隆抗体已进入临床Ⅰ/Ⅱ期实验阶段.但绝大部分癌细胞对TRAIL有耐受或引起耐受,耐受机制主要是由于IAP（Inhibitor of Apoptosis Protein）,Bcl-2（B-cell lymphoma-2）及cFLIP（cellular FLICE/caspase 8-like inhibitory protein,胞质凋亡抑制蛋白）家族蛋白的过表达而产生.因此,为了克服TRAIL的耐受,已有多种小分子IAP和Bcl-2拮抗剂在研发并进行临床实验.至今尚无cFLIP拮抗剂的报导.     

Mechanism of apoptosis of human osteosarcoma M-G63 induced by arsenic trioxide

Objective To observe the apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells induced by As₂O₃ and to explore its possible mechanisms. Methods The flowcytometric analysis and transmission electronmicroscope were performed to investigate the inducing apoptosis and inhibitative of As₂O₃ on osteosarcoma MG-63 cells. In order to study mechanism of apoptosis in MG-63 cells treated with As₂O₃, microarray was performed. The down-regulated gene was confirmed by RT-PCR, Northern-blotting. Results After treated with As₂O₃, hypodiploid peak before G0/G1 phase was observed in MG-63 cells through FCM analysis. Loss of microvilli, condensation and fragmentation of nuclear chromatin, condensation of cytoplasmic organelles, dilatation of the endoplasmic reticulum shrinkage of cells and alterations in cell membranes and apoptosis bodies which were observed in MG-63 cells treated with As₂O₃ by transmission electronmicroscope. The results of microarray show that As₂O₃ induced MG-63 cell apoptosis involves down-regulation of IEX-1 and the down-regulated gene is confirmed by RT-PCR and Northern-blotting. Conclusion The results show that As₂O₃ selectively inhibits growth of the solid tumor MG-63 cells by triggering apoptosis and indicates MG-63 induced by As₂O₃ cell apoptosis may through the IEX-1 pathway. Foundation item: Project (02JTY1005) supported by the Foundation of Science & Technology Department of Hunan Province; project (Y02-033) supported by the Foundation of Health Department of Hunan Province     

雷公藤红素对人肝癌细胞Hep3B中HIF-1α表达的影响

为探讨雷公藤红素对人体肝癌细胞Hep3B中缺氧诱导因子（HIF-1a）活化的影响,利用氯化钴（CoCl2）模拟肝癌细胞缺氧模式,采用双荧光素酶报告基因法检测雷公藤红素对HIF-1α的转录活性,蛋白免疫印迹实验检测雷公藤红素对HIF-1α蛋白质的表达水平,RT-PCR检测雷公藤红素对HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达水平,电泳泳动度移动分析（EMSA）检测雷公藤红素对HIF-1αDNA的结合能力.结果显示：雷公藤红素呈剂量依赖性抑制了HIF-1α蛋白质的表达水平,降低了肝癌细胞中VEGFmRNA的表达水平并有效抑制了HIF-1α蛋白的DNA结合能力.这表明,雷公藤红素可以抑制肝癌细胞中HIF-1α的活性,这可能是其抗肿瘤的机理之一.     

微生物脱硫菌株的筛选及其代谢产物分析

从油污土壤中筛选出一株脱硫菌YZ-1,该菌能将二苯并噻吩(DBT)代谢生成二羟基联苯(2- HBP),经生理生化鉴定为红球菌属(Rhodococus sp．)。对DBT培养代谢产物进行了分析。Gibb’s试剂显色反应表明,代谢产物中有2-HBP存在。气相色谱-质谱联用分析结果表明,DBT代谢产物中同时存在2-HBP和二苯并噻吩砜(DBTO2)。氯化钡测试表明,DBT中的硫元素被转化为硫酸盐。代谢产物综合分析表明,该菌株的代谢途径为微生物脱硫的“4S”途径。YZ-1菌株培养73 h,对初始浓度为0．5,1．0 mmol／L的DBT脱硫率分别为87．4％, 64．7％。YZ-1菌株在油水体积比为1:6时,活细胞培养120 h对柴油的脱硫率为26．68％。该菌株能够用于高硫柴油的深度脱硫研究。