含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化

目的优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽。方法采用单因素试验和L(934)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响;用5 L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略。结果影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度>起始pH值>甲醇添加量>诱导时间,最佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5%、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH 7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12 h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平;高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白。结论优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌遗传稳定性分析

目的分析表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌的遗传稳定性,为今后可能的大规模生产奠定基础。方法将分泌表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌在YPD液体培养基中连续培养200代,对原始工程菌及第200代工程菌的菌落和细胞形态、分泌表达情况以及目的基因的拷贝数等进行检测。结果第200代工程菌在菌落特征、菌体形态、分泌表达情况、Textilinin-1基因序列及拷贝数等均与原始工程菌一致。结论该毕赤酵母工程菌具有良好的遗传稳定性,适合大规模生产。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

分泌型重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中试发酵工艺的研究

通过对GM－CSF工程菌W3100发酵条件的研究，优化了培养及表达条件，使工程菌W3100在30L发酵罐可表达分泌型GM－CSF1.5g／L左右，占菌体总蛋白的25％以上，纯化后的比活大于2．0×107。     

表达人肝细胞生长因子突变体——NK4工程菌的发酵工艺研究

目的　建立重组NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法　采用锥形瓶、发酵罐发酵 ,对工程菌生长和表达条件如pH、诱导时间及诱导剂浓度等方面进行优化。确定其最佳诱导表达条件 ,在 15L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果　在 15L发酵罐进行工程菌发酵 ,菌体收获量湿重可达 2 4 .6g L± 0 .98g L ,目的蛋白的表达量保持在菌体总蛋白的 5 0 %左右 ,发酵时间为 11h。结论　建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。     

酵母工程菌降解纤维素的研究进展

利用基因重组技术构建酵母工程菌降解纤维素生产乙醇是一条可行的途径,概述了两类不同酵母表达系统,综述了目前纤维素酶基因克隆及其在酵母中表达的研究现状,指明了酵母工程菌在降解纤维素中的应用前景.     

毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化

对毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶的培养条件进行优化。单因素实验结果表明,该菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳氮源为酵母膏;通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养条件为30℃、接1种量10％、初始pH5．5、初始甲醇含量1．0％;甲醇最佳诱导时间为18h,经优化后,木聚糖酶酶活达到1765IU·ml^-1。该酶耐热温度为70℃。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

不同诱导剂对工程菌发酵及重组蛋白表达的影响

目的观察不同诱导剂对工程菌发酵及HSP-MUC1重组蛋白表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。方法分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,发酵表达HSP-MUCI重组蛋白质,并对重组蛋白质表达量和性状进行分析。结果用IPTG诱导发酵的菌体经普通匀浆法即可将细菌破碎;而用乳糖发酵的菌体经普通匀浆法不能破菌,通过延长发酵时间也能达到与IPTG诱导相同的表达量。结论乳糖可以作为基因工程重组蛋白的理想诱导剂。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展

构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等,是研发新生物制品的趋势之一,实现酵母工程菌的高密度发酵是维持制品生产规模和降低成本的重要技术途径。本文就影响酵母工程菌高密度发酵的因素,包括菌株的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类及配方、发酵罐结构及性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等及在生物制品和生物制药行业中酵母工程菌细胞高密度发酵的进展作一综述。     

毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

核心链霉亲和素在毕赤酵母中的表达及纯化

目的构建核心链霉亲和素(core-streptavidin,CSA)酵母表达载体,表达、纯化CSA蛋白,并测定其活性。方法通过基因操作获得天然SA的核心活性区域基因片段,克隆至酵母表达载体p PIC9K,重组表达质粒p PIC9K-CSA经电击转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中,甲醇诱导表达CSA蛋白。利用硫酸铵沉淀、2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法纯化CSA蛋白,紫外光谱测定法检测CSA蛋白与生物素的结合活性。结果构建的CSA基因工程菌能有效表达目的蛋白,经硫酸铵沉淀、亲和层析两步法纯化后得到纯度约95%的CSA重组蛋白,其具有与生物素结合的活性,活性为13.6 U/mg。结论利用毕赤酵母表达系统能够有效分泌表达CSA蛋白,该重组蛋白具有良好的生物学活性,为CSA发酵产品的大规模纯化提供了依据。     

人碱性成纤维细胞生长因子在植物毛状根和毕赤酵母中的表达

目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pPICZα-hbFGF。通过发根农杆菌介导,将pCAMBIA1301-hbFGF质粒转入大豆毛状根;采用电转化法将质粒pPICZα-hbFGF转入毕赤酵母X-33菌株,PCR法筛选阳性转化子,诱导表达。筛选高效稳定表达株,发酵培养并优化发酵条件,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并进行纯化。结果经酶切及测序证明两个重组表达质粒构建正确;经PCR鉴定证明hbFGF基因已整合入大豆毛状根及毕赤酵母基因组中;筛选出了在两种体系中发酵培养的最佳条件;hbFGF在大豆毛状根和毕赤酵母中的表达量分别占总蛋白的31%和42%,且均具有良好的反应原性;经纯化后,均可见相对分子质量约18000的单一条带。结论 hbFGF能够在大豆毛状根和毕赤酵母中高效表达,为其大规模工业化生产奠定了实验基础。     

重组人aFGF工程菌发酵条件的优化

目的优化重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)工程菌的发酵条件。方法采用分批补料方式,在菌体快速生长阶段,通过变速流加碳源和氮源,控制流加比例,调节pH值和溶解氧(DO)含量,实现工程菌的高密度发酵及目的蛋白的高效表达。结果当碳源与氮源流加比例为3:1时,菌体湿重可达145g/L,干重达36g/L,目的蛋白表达量达28.9%;DO控制在20%时,全菌体和裂解液中目的蛋白的表达量均最高,分别可达29.11%和44.28%。结论已初步优化了rhaFGF工程菌的发酵条件。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

培养基因工程菌表达未酰化胸腺素α1的研究

通过摇瓶培养对含有Thymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21的生长和融合蛋白表达进行了研究.选择LB和TH培养基,考察了培养温度、摇瓶中培养基盛装量、葡萄糖添加量、诱导剂IPTG浓度、诱导时间等因素对工程菌生长和融合蛋白表达的影响.确定最适生长温度为35～37℃、最佳蛋白表达温度为30℃,对数生长中期诱导,诱导剂浓度为0.4～0.5 mmol·L-1,诱导时间为4～6 h.其融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的26.83%.