MBL EXONⅠ54位基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立MBL基因点突变的检测方法,探讨健康汉族人MBL 54位密码子基因突变的情况.方法根据MBL基因序列设计引物,建立MBL的PCR-RFLP测定点突变的方法.结果扩增产物测序结果与预期扩增的目的基因序列一致,检测灵敏度为80ng/ml,用其检测58例健康献血员54位密码子的点突变情况,野生型为29例,占50%;突变杂合型为27,占46.55%;突变纯合子型为2例,占3.45%.基因频率A为0.732 8;B为0.267 2.结论该方法是特异、灵敏的检测方法.     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。     

牛乳中蜡样芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立一种快速检测牛乳中蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列及荧光定量PCR要求,设计合适的特异性引物,提取菌体DNA,对目的基因进行扩增及克隆;以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线;以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。对建立的方法进行特异性及灵敏性验证。结果建立的方法检测其他3种牛乳中常见致病菌(大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌)未见特异性扩增,即无交叉反应;最低检出限为1×10~(-7) ng/μL。以掺入蜡样芽孢杆菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中10. 4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌,优于国标方法(GB 4789. 14-2014)检测含有相同菌落数的蜡样芽孢杆菌(仅能检测到1. 04×10~2 CFU/mL)。结论建立的方法特异性强,灵敏性高,适用于快速、准确检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌,为实验室快速检测致病菌提供了参考。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

目的建立猪细小病毒(PPV)PCR检测方法。方法设计一对针对PPV的特异引物,经方阵滴定法确定PCR检测的最佳条件,以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行斑点杂交鉴定。提取已知滴度的病毒培养物DNA为模板,稀释后进行PCR扩增,测定PCR方法的敏感性。采用此方法检测了180份猪各种组织样品的DNA及PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型。结果仅PPV野毒株和北京分离株AV7909能够扩增出一条531bp的片段,测序结果证明为PPV的特异片段。该方法所能检测的最小病毒滴度值为0.398TCID50,可以检测出PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型中0.500 TCID50的感染量。180份组织样品均未检出PPV。结论该方法具有良好的特异性和敏感性。     

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

在应用猴肾细胞制备的脊髓灰质炎减毒活疫苗中有SV40污染的可能。根据T-ag，t-ag和VP1三段基因，设计3对引物LT2：上游2805—2822bp，下游3946．3964bp；ST：上游4638—4663bp，下游5113—5137bp；VP1b：上游2022—2042bp，下游2496—2517bp。通过PCR方法对猴肾脏、肺脏、脾脏及脊髓灰质炎减毒活疫苗进行检测，确定是否存在SV40感染或污染。     

一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R~2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10~(-3)的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。     

流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型(egg drop syndrome virus,EDSV)的荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法针对EDSV六邻体蛋白保守区分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的线性、特异性、精密性、灵敏度及可行性。采用新建立的荧光定量PCR法对16株流感疫苗主种子批毒种进行外源性EDSV检测。结果该方法的最佳线性范围为1×10~4~1×10~9 copies/μl,回归曲线为y=-3.385 x+39.616,R~20.99;与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应;试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均2%;灵敏度为101 copies/μl;该方法检测P0代样品的最低检测限为10-6掺入体积比例,血清学方法检测P0~P3代样品的最低检测限为10~(-2)~10~(-3)掺入体积比例。该方法检测16株流感毒种中外源性EDSV的结果均为阴性,与血清学方法检测结果一致。结论成功建立了检测EDSV的荧光定量PCR法,提高了检测灵敏度和检测效率,更好地满足了流感疫苗应急检验中快检的要求。     

巢式PCR-RFLP检测大便K-ras基因第12位密码子点突变

用巢式PCR－RFLP分析技术,扩增大便中K－ras基因第12位密码子所处的一段外显子,根据BstNI内切酶的多态性,分析K－ras基因第12位密码子是否突变。结果在22例结肠直肠癌患者的术后石蜡包埋组织中,检出10例（45.5％）K－ras突变,该10例患者中,有8例（36．4％）患者的术前大便中检出K－ras基因突变。这种方法快速、简便、特异、敏感,且可避免大便中多种物质对PCR的干扰。对可疑人群具有实际应用价值。     

用于基因转运和治疗的多功能纳米复合物的制备及应用

基因治疗是将DNA转染进入目的细胞,修复遗传错误或者产生治疗因子。目前基因治疗研究的热点是利用纳米颗粒作为载体,将特异性基因转染到细胞内,从而达到基因治疗的目的。纳米颗粒作为载体可使基因的转染效率提高、增强其稳定性、靶向型。就纳米复合物的组成及在基因治疗方面的应用、面临的问题与挑战进行了综述。     

赤霉素产生菌原生质体理化诱变-定向筛选模型的建立与应用

针对赤霉素工业生产菌株皆为不产生孢子的多核多细胞菌丝型,通过酶解手段溶去赤霉素菌丝体的细胞壁,使其成为单一游离的原生质体,在此基础上建立赤霉素产生菌原生质体抗药性致死突变标志诱变筛选模型,以解除高浓度反应底物及内源赤霉素对其产生菌生物合成的反馈抑制和阻遏,提高赤霉素生物合成酶的活力,从而获得赤霉素高产菌株。应用所建立的赤霉素诱变筛选模型,进行产生菌原生质体理化诱变-定向筛选,成功得到N7298等多株原生质体再生的抗药性突变高产菌株,其摇瓶效价比出发菌株N提高23.4%,在20m3罐生产水平提高24.1%。     

一种改良Rh血型基因及其单倍型频率估计方法的推导

目的推导出一种符合实际工作的Rh血型基因及其单倍型频率估计方法。方法基于目前普遍使用5种血清鉴定Rh血型的实际情况,根据Hardy-Weinberg定律,得出每种表现型频率和相应遗传型频率之间的关系,从而推导出计算Rh血型基因及其单倍型频率的公式;应用本文方法及另一种方法进行实例计算,并比较结果。结果计算结果显示,两种方法算出的P值均大于0.05,显示观察值与期望值差异无统计学意义,Hardy-Weinberg吻合度良好,但用本文方法算出的P值较大。结论本文方法符合目前检测Rh血型的实际情况,且估计其基因及单倍型频率的效率较高,是一种效果良好的改进型Rh血型单倍型频率估计方法。     

儿童及成人头发皮质醇检测方法的建立及应用

目前检测皮质醇主要的方法是通过检测血液、唾液以及尿液中的皮质醇浓度,但这只能反映人体的应激压力,而头发皮质醇含量则可以反映人体慢性压力.建立了一种定量检测头发皮质醇含量的方法,比较了一步法与四步法测定头发皮质醇含量的差异,探讨了磷酸盐缓冲液(PBS)体积、样品放置时间等因素对测定结果的影响.结果 表明,四步法比一步法更...     

Effect of pH on the Interaction of Gold Nanoparticles with DNA and Application in the Detection of Human p53 Gene Mutation

Gold nanoparticles (GNPs) are widely used to detect DNA. We studied the effect of pH on the assembly/disassembly of single-stranded DNA functionalized GNPs. Based on the different binding affinities of DNA to GNPs, we present a simple and fast way that uses HCl to drive the assembly of GNPs for detection of DNA sequences with single nucleotide differences. The assembly is reversible and can be switched by changing the solution pH. No covalent modification of DNA or GNP surface is needed. Oligonucleotide derived from human p53 gene with one-base substitution can be distinguished by a color change of the GNPs solution or a significant difference of the maximum absorption wavelength (λ_max), compared with wildtype sequences. This method enables detection of 10 picomole quantities of target DNA.     

再生纤维素纤维原纤化测试方法的建立与应用

Lyocell纤维原纤化测试方法中,超声波振荡法设备简单、条件易于控制。在已有的超声波振荡法基础上,通过研究影响原纤化产生的因素,获得具有重复性的稳定处理条件,即超声波功率为500 W,超声振荡处理时间为30 min,探头离试样瓶底高度为10 mm,纤维样品量为1 mg时,可以获得清晰的原纤化效果图,纤维样品之间的原纤化程度容易区分辨识,并可进行原纤化指数的定量计算。应用此条件对不同来源的再生纤维素纤维进行处理,能够通过原纤化程度明显区分常规Lyocell纤维、抗原纤化Lyocell纤维、普通黏胶纤维和Modal纤维,说明优化的超声波振荡条件可以作为建立Lyocell纤维原纤化测试标准的依据。     

A Comparison Between a Semi-Continuous Analyzer and Filter-Based Method for Measuring Anion and Cation Concentrations in PM10 at an Urban Background Site in London

A comparison between the filter-based, laboratory ion chromatography technique and a semi-continuous analyzer (URG 9000B Ambient Ion Monitor [AIM]) was conducted to evaluate the performance of the AIM in measuring the concentrations of the main airborne ionic species in PM₁₀. The study was carried out in an urban background area of London (UK) in 2013. The two methods showed an overall good correlation (R² > 0.83) for nitrate, sulfate, chloride, ammonium, and magnesium and poor correlation was found for sodium, potassium, and calcium (R² < 0.50). The AIM gave consistently higher concentrations for sodium and potassium, possibly due to a positive bias within the sampling unit. During high concentration episodes, both the efficiency of the particle extraction and removal of gases by the denuder may be reduced. A HEPA filter test demonstrated that the denuder was removing gaseous components effectively but that there was some potential for contamination. Overall, the AIM was found to be a good instrument for measuring hourly anion and cation concentrations in PM₁₀ in urban sites.

Copyright 2015 American Association for Aerosol Research