发酵后期补加2种氮源对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

为探寻解决重要平台化合物1,3-丙二醇发酵后期菌体生长和1,3-丙二醇合成受限的方法,通过从菌体量、产物和关键酶活性及基因转录水平等方面,较全面地考察了发酵后期补加酵母膏和硫酸铵对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)合成1,3-丙二醇的影响,结果为:添加两种氮源均有利于菌体生长;补加10 g/L酵母膏和硫酸铵,1,3-丙二醇产量由58.6 g/L分别提高到70.6 g/L和77.2 g/L;相对于酵母膏,硫酸铵对关键酶活性的增强更为明显,并使甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase,Dha D)在发酵后期始终维持较高水平,促进细胞生长和产物合成。此外,与补加酵母膏相比,补加硫酸铵后关键酶基因转录水平上调并不显著。表明硫酸铵主要通过直接激活关键酶活性促进细胞生长和产物合成。综上所述,发酵后期补加硫酸铵更利于1,3-丙二醇的生物合成,是提高发酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。     

生物催化合成1,3-丙二醇工艺的研究

以甘油为底物,利用克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的实验中,考察了初始甘油浓度、温度、pH、通气策略等发酵条件对1,3-PDO产量的影响。实验结果表明：积累1,3-PDO的适合条件为：甘油的初始浓度为40g/L、发酵温度37℃、pH7.0、0.5V/V·min的通气量,发酵30h,反应液中PDO的产量可达57.63g/L。     

克雷伯氏菌发酵条件的响应面设计

以中心组合设计为基础利用响应面法,对克雷伯氏菌利用甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的培养条件进行优化,建立了以甘油、硫酸铵、pH值、发酵时间、和发酵温度对1,3-PD发酵生产的单个因素和交互影响的数学模型,得到发酵生产1,3-PD的最佳条件为:甘油49.9g/L;硫酸铵5.28g/L;pH值为7.19;培养时间84h;温度36.1℃。在此条件下,模型预测1,3-PD最大产量为19.03g/L。并在此条件下进行实际实验,1,3-PD的产量为18.33g/L,与模型预测接近。     

克雷伯氏菌固定化技术发酵生产1,3-丙二醇

通过对4种常见的包埋材料固定化克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的研究发现,海藻酸钙固定化无论在制备难易还是在发酵强度上都有很大优势,并进一步确定了海藻酸钙固定化的最优条件:海藻酸钠质量浓度6%,CaCl2质量浓度4%,交联时间4 h。相对于游离发酵,固定化发酵1,3-丙二醇终浓度提高了7.4%,发酵强度达到了1.04 g/(L.h)。此外,固定化克雷伯氏菌还能用于1,3-丙二醇半连续发酵。     

Klebsiella pneumoniae在不同发酵罐中发酵甘油制1,3-丙二醇的控制条件研究

对克雷伯氏肺炎杆菌间歇发酵甘油产生1,3-丙二醇的发酵条件进行了优化,确定了50L搅拌式发酵罐和15L气升式发酵罐发酵的最佳发酵条件,得到的1,3-丙二醇的浓度、生产率和甘油摩尔转化率分别是80.97g/L、1.69 g/(h·L)、0.57 mol/mol和74.81 g/L、1.56 g/(h·L)、0.50 mol/mol;对比了不同类型发酵罐的发酵结果,表明50 L搅拌式发酵罐发酵结果优于15L气升式发酵罐,前者相对于后者来说,1,3-丙二醇的浓度和甘油摩尔转化率分别提高了8.23%和14.91%;确定了最适底物浓度(以初始甘油浓度计)在25 g/L左右。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

有氧条件下pH值调控方式对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响

研究了有氧条件下,以粗甘油为底物,由克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)发酵生产1,3-丙二醇中不同通气量和3种不同的pH值调控方式(NaOH调控、NaOH和CaO联合调控、CaO调控)对菌体生长、1,3-丙二醇生成的影响.研究表明,空气通量为0.2L/rain最适合1,3-丙二醇的生产,1,3-丙二醇的最终浓度为17.96g/L;在有氧条件下,通过CaO调控pH值,可获得最高菌体密度,当发酵进行至48h时,1,3-丙二醇浓度可达62.4g/L,明显优于其他2种调控方式的1,3-丙二醇的发酵结果.     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建

该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）中的乙醛脱氢酶（aldH）基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。     

用克雷伯氏菌批式流加发酵法生产1,3-丙二醇

通过对克雷伯氏菌在 7L发酵罐中厌氧间歇发酵甘油生产 1,3 丙二醇的实验研究 ,建立了一种与 pH调节相偶联的批式流加甘油发酵策略。考察了不同甘油维持浓度条件下的流加方式及不同培养方式对 1,3 丙二醇产率的影响。结果表明 ,甘油质量分数维持在 2 %的流加方式有利于 1,3 丙二醇的发酵生产 ,其在 30 5h内消耗甘油 2 80 g ,得到 1,3 丙二醇152 6 g ,摩尔转化率 6 5 5% ,生产强度 0 91g/L·h     

两步发酵法生产1，3-丙二醇的研究

通过几种不同原料制备的甘油对克雷伯杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇的影响的比较实验,验证了两步发酵法生产1,3-丙二醇工艺路线的可行性。在甘油初始浓度相同(70g/L)的条件下,以葡萄糖为原料进行发酵得到的甘油转化为1,3-丙二醇的效果较好,发酵15 h,甘油转化为1,3-丙二醇的摩尔转化率为45．1%；皂化甘油生产1,3-丙二醇的发酵时间为18h,摩尔转化率为44．2%；而以玉米淀粉水解液发酵的甘油转化为1,3-丙二醇需要31 h,摩尔转化率仅为26．5%。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

Overexpression of the genes of glycerol catabolism and glycerol facilitator improves glycerol conversion to ethanol in the methylotrophic thermotolerant yeast Ogataea polymorpha

Production of fuel ethanol is one of the possible ways to utilize crude glycerol, substantial amounts of which are produced by biodiesel industry. Earlier, we have described construction of the recombinant strains of methylotrophic thermotolerant yeast Ogataea polymorpha with simultaneous overexpression of the genes PDC1 and ADH1, which produced increased amounts of ethanol from glycerol. In this work, we have further improved these strains by overexpression of genes involved either in oxidative (through dihydroxyacetone) or phosphorylative (through glycerol-3-phosphate) pathway of glycerol catabolism, as well as heterologous gene coding for glycerol transporter FPS1 from Komagataella phaffii (formerly, Pichia pastoris). Obtained recombinant strains produced up to 10.7 g/L of ethanol (with ethanol productivity 30 mg/g of biomass/hr and yield 132 mg/g of consumed glycerol) from pure glycerol and up to 3.55 g/L of ethanol (with ethanol productivity 11.6 mg/g of biomass/hr and yield 72.3 mg/g of consumed glycerol) from crude glycerol as a carbon source, which is approximately 15 times more relative to that of the O. polymorpha wild-type strain and 2.2 more relative to the earlier constructed strain.     

Cu~(2+)对酿酒酵母酒精发酵特性的影响

本文利用两株酿酒酵母Freddo(F菌)、BH8(B菌)和模拟葡萄汁发酵体系,研究了不同浓度Cu2+对酿酒酵母生长和发酵特性的影响。结果表明,Cu2+抑制发酵前期酵母生长、酒精发酵的程度和延长酒精发酵时间与Cu2+浓度正相关,当Cu2+浓度达到0.2 m M时,酵母酒精发酵出现提前终止。发酵结束时,B菌对照组葡萄糖和果糖的残留量为2.51 g/L、10.80 g/L,Cu2+0.1 m M处理组葡萄糖和果糖残留量分别为0.43 g/L、3.43 g/L,Cu2+0.1 m M处理促进了B菌发酵后期对糖的利用;F菌Cu2+处理组与对照组残糖量之间不存在显著性差异。B菌Cu2+0.1 m M处理组酒精总产量为10.80%,显著高于对照组的10.27%与Cu2+0.05 m M处理组的10.37%。B菌Cu2+0.05 m M处理组的甘油产量为6.66 g/L,显著高于对照组的6.37 g/L与Cu2+0.1 m M处理组的6.29 g/L;F菌Cu2+处理组与对照相比,酒精和甘油总产量之间不存在显著性差异,可见,不同株酵母对Cu2+逆境的适应性不同的。     

基于途径分析的产甘油有孢汉逊酵母菌株的选育

以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）GF-23为出发菌株,对其甘油的合成代谢途径进行分析并提出育种策略。 对 菌株GF-23进行诱变筛选,最终得到一株耐高渗高产甘油的葡萄汁有孢汉逊酵母突变菌株GY-1。结果表明,突变菌株GY-1的耐氯化 钠质量浓度达到50 g/L,在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基中培养2 d时,甘油产量为0.44%,是出发菌株的3.33倍;接种在葡萄汁中 发酵6 d后,甘油产量达到0.49%,是出发菌株的4.45倍。 葡萄发酵液中的残糖量为3.03 g/L,酒精度为3.86%vol,说明突变菌株GY-1能 够适用于葡萄酒的发酵。 对突变菌株连续传代5次以上,其遗传性状稳定且甘油产量均无明显变化。     

高产Monacolin K红曲霉菌种的筛选及液态发酵条件优化

为了提高红曲霉（Monascus ）液态发酵生产Monacolin K的能力,一种新型的常压室温等离子体（ARTP）诱变技术被应用于产Monacolin K红曲霉菌株的诱变选育工作;同时,通过构巢曲霉（Aspergillus nidulans ）平板对峙培养的筛选方法,选育获得较初始红曲霉菌Monacolin K产量提高60%以上的突变菌株MP60-6。确定发酵培养基组成为甘油5%,米粉50 g/L,蛋白胨15 g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4 1 g/L,ZnSO4 2 g/L,KH2PO4 1.5 g/L,并进一步确定在发酵第3、第4天添加0.1%的乙酸和0.2%的柠檬酸,发酵第8天补加10%的甘油。在上述条件下发酵17 d后Monacolin K产量可以达到1 302 mg/L,为出发菌株产量的2.66倍。     

代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸

为了构建高产丁二酸的重组大肠杆菌,以删除了乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的大肠杆菌CICIM B0013-025为出发菌株,将其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子替换为温度诱导的λ噬菌体启动子P_L-P_R,获得温度调控型的丁二酸合成菌株B0013-026。继而通过发酵条件优化,建立了两阶段发酵法:菌株的生长温度和诱导温度分别为37和42 ℃,以甘油为碳源并添加入5 g/L蛋白胨,发酵产酸阶段在微供氧(100 r/min)条件下进行。在5 L发酵罐中采用最优条件进行发酵,丁二酸的产量、生产强度和甘油转化率分别为62.5 g/L、1.04 g/(L·h)和64.2%,而且发酵液中仅有少量的α-酮戊二酸(3.0 g/L)和乙酸(1.8 g/L)等副产物积累,实现了以甘油为唯一碳源高效合成丁二酸,为其工业化生产提供了重要参考。     

伊枯草菌素A高产菌株的筛选鉴定及发酵工艺研究

该研究采用平板对峙法及高效液相色谱（HPLC）法从土壤中筛选高产伊枯草菌素A（iturin A）的菌株,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并以iturin A产量为评价指标,对培养基成分及发酵条件进行研究。结果表明,筛选得到1株高产iturin A的菌株,编号为ND,并鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;其产iturin A的最佳培养基成分为豆粕粉120 g/L、酵母浸粉16 g/L、L-谷氨酸钠1 g/L、甘油70 mL/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L;最佳培养条件为装液量12%、初始pH值8、接种量10%、培养温度28 ℃、培养时间5 d。在此最优条件下,菌株ND的iturin A产量为4.76 g/L,是优化前（0.35 g/L）的13.6倍。     

响应面试验优化产琥珀酸放线杆菌GXAS137发酵粗甘油产丁二酸工艺

通过优化产琥珀酸放线杆菌GXAS137发酵粗甘油产丁二酸的培养基,提高丁二酸产量,降低生产成本。先通过单因素试验对粗甘油发酵产丁二酸的电子受体、初始粗甘油质量浓度及氮源进行了优化,再利用响应面试验确定重要参数的最佳水平。结果表明：二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）为最适电子受体,玉米浆可替换酵母粉作为氮源,各因素的最佳条件为：初始粗甘油质量浓度55.43?g/L、DMSO质量浓度10.35?g/L、玉米浆质量浓度17.69?g/L。优化后丁二酸产量达到37.02?g/L,丁二酸得率为66.79%,生产强度为0.51?g/（L·h）。与初始条件下丁二酸产量（16.88?g/L）相比,优化后提高了1.19?倍。本研究为微生物发酵粗甘油原料生产丁二酸提供了理论支持。     

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力,对高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM109进行培养,优化了发酵培养基成分、培养条件以及发酵工艺,结果表明,最佳葡萄糖浓度为20 g/L,碳氮比为7.86,添加5 g/L酵母粉和蛋白胨有利于菌体产酶,最佳发酵液初始pH为7.5,接种量为10 %.通过以上优化,重组大肠杆菌培养18 h时酶活可达到70 U/g(DCW),酶活比原工艺提高了1.6倍.