黑曲霉HD9478纤维素酶固体发酵条件的研究

通过激光诱变筛选，获得一株高产纤维素酶的突变株ＨＤ９４７８，在以稻草，麦麸为主要原料的固体培养基上进行发酵培养，所产纤维素酶的固体曲，以羧甲基纤维钠为底物的纤维素Ｃｘ酶活力为３５００Ｕｇ，以滤纸为底物的纤维素ＣＬ的酶活力的２６０Ｕ／ｇ，以水杨素为底物的β－葡萄糖苷酶活力为１２００Ｕ／ｇ，发酵培养的条件是培养基起始ｐＨ６．０～７．０，培养温度２８～３２℃，培养时间７２ｈ。三种酶作用的最适ｐＨ分别为３     

产纤维素酶细菌的选育

以产纤维素酶芽孢杆菌JJQ8为出发菌株，进行了紫外线和HNO2诱变处理，采用透明圈法初筛和摇瓶培养复筛，获得2株高产纤维素酶的突变株HS—T001和HS-T002。与出发菌株相比，经紫外线诱变处理的HS．T001突变株产酶活力提高了1．9倍，用HNO2诱变处理的HS—T002突变株产酶活力提高了2倍。     

胆固醇氧化酶发酵研究

对从土壤中筛选到的菌株ＤＧＣ－００７进行ＵＶ诱变,选育到菌株ＤＧＣ－０４８．对影响突变株产酶的条件进行了优化,初步确定了ＤＧＣ－０４８合适的产酶摇瓶培养基组成．在发酵温度为３０℃,培养基起始ｐＨ７．５～８．０的条件下,接种量１０％,发酵４８ｈ,产酶可达３５０μｍｏｌ／（ｍｉｎ·Ｌ）     

一株产品纤维素酶细菌M7的紫外诱变选育

以细菌M7为出发菌株,通过紫外诱变处理,经刚果红培养基初筛及摇瓶发酵复筛获得突变株。经紫外诱变获得6株正突变株以第2株产酶活力最高,CMCase、FPA相对酶活力较原始菌株提高了6．06倍、6．88倍。紫外诱变可使细菌M7产纤维素酶活力提高。     

He-Ne激光对红曲霉M9x的原生质体诱变育种

采用He—Ne激光诱变红曲霉M9x原生质体，获得一株Monacolin K产量为103．73μg／ml的诱变株M9y，其产量约是出发菌株M9x的4．1倍，经酯酶同工酶分析，其酶带条纹数、迁移率等均发生了明显变化。对诱变株进行传代稳定性试验，结果表明：经斜面传代八代以后，诱变株M9y的Monacolin K产量仍较稳定，无明显的回复突变。     

提高AS1．398中性蛋白酶发酵水平的研究

对中性蛋白酶生产菌AS1．398采用紫外线照射和亚硝基胍复合诱变，从上千株菌选出138株菌，用平皿快速检出法和Folin法测定酶活力，并经过复筛最终获得6株高产菌株，其中NP-72菌的酶活力达到10606u／mL，比原菌提高49％。对NP-72菌纯化分离获得NP-72-7菌，经发酵工艺优化，其摇瓶产酶活力达到11361u／mL，比原菌株提高了59．5％。     

弹性蛋白酶产生菌的化学诱变选育

从湖北工业大学巡司河附近的土壤和污水中采集到的3个样品，经富集培养，分离到14株能产生弹性蛋白酶的菌株，反复初筛、复筛后，分离到一株产胞外弹性蛋白酶较高且稳定的细菌，经初步鉴定属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilia）。该菌的生长温度为37℃，属革兰氏阳性菌，要求培养基的pH为7．0，对该菌进行化学诱变，诱变剂选用硫酸二乙酯（DES）。诱变处理后绘制致死曲线。诱变浓度为1％，诱变时间为50min时，该菌的致死率迭到77．5％。在此诱变剂量下，选透明圈直径与菌落直径之比最大的菌落进行酶活测定，在波长为495nm同一稀释倍数下，诱变前该菌酶活为74．25U／mL。诱变后的酶活为98．55U／mL，较出发菌株提高了33％。     

果胶酶高产菌株的激光选育及发酵条件的优化

利用氦氖激光诱变原生质体筛选到了一株产果胶酶性能稳定且酶活明显提高的突变株ZH-2。其最适发酵条件为：以2％桔皮粉＋1％乳糖作碳源，以1％（NH4）2SO4＋0．3％酵母膏作氮源，在起始pH7．0，33℃摇床发酵32h左右达产酶高峰。分析ZH-2所产果胶酶的性质得出，酶作用最适条件为：pH6．5，50℃，以聚半乳糖醛酸为底物，酶的热稳定性实验显示，50℃保温60min后，酶活力基本不变。     

植酸酶产生菌的选育及产酶条件的初步研究

经大量菌种初筛和复筛，得到一株产植酸酶较高的菌株G8。菌种经NTG和Co^60诱变，得到一株植酸酶高产菌株CN-50，适合该菌种产植酸酶的优良培养基：豆饼粉，麸皮，硫酸铵。最适宜产酶条件：培养温度30℃，培养基起始PH是5．5，时间为72h。     

α-葡萄糖苷酶菌株的选育及其产酶条件的研究

从土壤中筛选出一株高产α-葡萄糖苷酶的菌株,经鉴定为黑曲霉。在此基础上,利用离子注入技术对其进行诱变处理,选育出一株高产突变株AL7,经10代传代培养其遗传性状稳定的。通过对产酶条件进行优化,使其产酶量为9．24U,较出发菌株提高了4．18倍。     

不同发酵剂和工艺环节对发酵牛肉调味基料抑菌性的影响

为研究不同发酵剂和工艺条件对发酵牛肉调味基料（fermented beef flavorings,FBF）抑菌性的影响,以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）和乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）为目标菌,添加10% FBF于目标菌中,37 ℃培养12 h,计算其对不同目标菌的抑制率。设计3 组实验：CK组（热压浸提-酶解-美拉德反应）;2）反应Ⅰ组（热压浸提-酶解-发酵）,在发酵环节接种15 种商业复合菌或单株菌;3）反应Ⅱ组（热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应）,在反应Ⅰ的基础上继续进行美拉德反应。结果表明：不同工艺制得的处理组FBF,其抑菌能力从强到弱依次为反应Ⅱ组＞反应Ⅰ组＞CK组;CK组对P. Aeruginoosa和S. paratyphi B无抑菌能力,对E. coli的抑制率最高（61%）,其次是S. aureus（20%）和S. typhimurium（11%）;反应Ⅰ制得的FBF除对P. Aeruginoosa无抑制能力外,对其余4 株目标菌的抑制率均提高,其中,以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对S. typhimurium的抑制率可达55%;反应Ⅱ制得的15 种FBF对5 株目标菌均有较强的抑菌性,以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对S. typhimurium的抑制率达85%,对E. coli的抑制率达53%,以WBL-45为发酵剂制得的FBF对E. coli的抑制率达100%,对S. paratyphi B的抑制率达85%。最终选定WBL-45、清酒乳杆菌为制作FBF的发酵剂,采用热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应工艺制作FBF,得到的产品抑菌性较强。     

中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

从土壤中分离到一株高产中性植酸酶的菌株,酶活力达12.52U/mL。对其进行形态、生理、生化、分子生物学鉴定,初步鉴定为放射型根瘤杆菌(Agrobacterium radiobacter)。酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH 值为7.0;65℃处理60min 酶活力保持80% 左右,有一定耐热性;在pH5.5～8.0 之间,稳定性较好;Ba2+ 对酶活力有一定的激活作用,Fe2+、Mg2+、Zn2+ 和Cu2+ 对酶活力均有一定程度的抑制作用,其中Fe2+ 的抑制作用最强。     

一株葡聚糖酶产生菌的分离选育及鉴定

利用葡聚糖平板初筛,三角摇瓶复筛,从土壤样品中中分离得到一株葡聚糖酶高产菌株P5,发酵酶活力可以达到2.5U/mL。菌株呈长杆状、革兰氏染色阳性、产芽孢;生理生化实验结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌最为相近;16S rDNA基因序列包含1510个碱基对,同源性分析显示该菌株与枯草芽孢杆菌菌株最为相近,最高相似性为99%,基于16S rDNA基因序列的系统发育分析显示,该菌株与枯草芽孢杆菌菌株CD-6及YPM8的亲缘关系最近,根据以上多相分类结果鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。     

产耐热普鲁兰酶菌株的分离、筛选与鉴定

从某火山口的土壤样品中分离筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株T-10,酶活力为1.22 U/m L。经形态特征观察、生理生化特征实验以及16S r DNA序列同源性分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。酶学性质研究表明:该普鲁兰酶的最适温度是60℃,在70℃保温4 h后活力残留60%以上;最适p H值为6.0,p H 3.0~8.0在室温保存4 h后相对酶活力大约为70%。目前,鲜有发现产耐热普鲁兰酶的菌株为解淀粉芽孢杆菌,其具备良好的应用前景。     

一株蛋白酶产生菌的分离鉴定

从郑州奶牛场土壤样品中分离到一株芽孢杆菌,命名为A—19菌株。该菌株有较高的蛋白酶活性,37℃、pH7．0培养48h后,其蛋白酶活力可达63．5U/mL。菌体生长专性需氧,有运动性,粗糙型菌落,氧化酶试验阳性,DNA（G＋C）的摩尔分数为47％。该菌株的16SrDNA序列与芽孢杆菌属有很高的同源性,Bacillus vallismortis（99．61％）,B．subtilis（98．81％）,B．amyloliquefaciens（98．95％）,B．licheniformis（97．93％）。通过其生理生化特征和16S rDNA序列相似性的系统发育分析,确定A—19菌株属于芽孢杆菌属。该菌的16S rDNA序列已被GenBank收录,序列登陆号为EU561347。     

瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究

从瑞氏木霉（Trichoderma reesei）cDNA文库中克隆到外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）eDNA基因,将该基因分别连接到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pAJ401和pVT100_U上,构建了重组质粒pAJ401-cbhl和pVTIOO_U-cbhl。分别电转化2个重组质粒转移至酿酒酵母H158中,得到重组酵母HPC和HAC,实现了CBHI的分泌型表达。再将质粒pAJ401-cbhl转入已含有瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因egl的重组酵母Hlm中,构建了同时表达cbhl和egl的重组酵母菌株HMEPC。比较HMEPC和Hlm对纤维素底物的降解,前者滤纸酶活比后者提高14．3％,表明CBHI与EGI对滤纸降解有协同作用。     

组成型分泌表达蛋白酶的重组粪肠球菌的构建及应用

为构建组成型分泌表达蛋白酶Ker的重组粪肠球菌,采用豆粕固态发酵实验并评估其应用效果。以重组质粒pSIP401-kerhds为基础框架,向其中引入组成型启动子p10和高效分泌信号肽S6,构建重组载体pSIP401Z-s6-kerhds。采用电击转化方法将该重组载体转入具有益生特性的粪肠球菌EXW27来构建重组粪肠球菌。重组粪肠球菌的胞外蛋白酶的比酶活力为125.37 U/mL。重组蛋白酶Ker的最适反应温度为40℃,在pH 5.0~10.0范围内具有较高的相对酶活力和稳定性,并对胆盐溶液具有较好的耐受性,可适用于动物肠道环境。豆粕固态发酵实验表明,与粪肠球菌EXW27相比,重组粪肠球菌可以更有效降解豆粕中蛋白质。该研究构建了既具有益生特性又具有蛋白酶活性的重组粪肠球菌,为开发新型微生态制剂奠定了基础。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

耐有机溶剂脂肪酶菌株的筛选及其耐受特性初探

以筛选获得的新疆酿酒葡萄内生菌为出发菌株,首先采用含有橄榄油乳化剂及罗丹明B的平板初筛,再分别以体积分数1%正庚烷和1%甲苯为筛选压力进行复筛,从中得到1株耐有机溶剂脂肪酶菌株M-CY1,经形态和分子生物学技术鉴定为Penicillium asturianum。该菌遗传稳定性良好,菌种的酶活性与菌丝的生长量呈正相关,多种有机溶剂对该菌产脂肪酶活具有促进作用,其中二甲苯作用最为明显,酶活为4.99 U/mL,相对酶活达143.76%。     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。 重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。