中性蛋白酶高产菌株的诱变选育

对产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SHB 2010-1进行物理和化学诱变以筛选高产菌株。考察了6种筛选培养基在分辨中性蛋白酶高产菌株上的效率,菌株在脱脂牛奶培养基上生长状态最佳,水解圈易于观察。以紫外线、硫酸二乙酯为诱变剂,研究了两者的致死率曲线,选择致死率为90~95%的剂量进行两轮复合诱变,诱变菌的发酵液酶活依次较出发菌提高1.49%、10.99%、38.77%和59.68%,复合诱变表现出较单一诱变更强的效应,并能利用弱诱变剂紫外线积累的隐性突变。最终筛选得到的菌株命名为DES-59,在50 mL发酵培养基中培养60 h酶活达到7307 U/mL,相应的生物量为2.205×1010 CFU/mL,表现出典型的生长偶联型。突变菌的nprE基因经克隆及测序与数据库上的序列一致,酶活性的提高并非由中性蛋白酶A结构改变引起,突变出现在生产蛋白酶的其他位点上,有利于潜在性能的提高。     

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展

中性蛋白酶因作用条件温和广泛应用于食品、医药以及饲料等领域。枯草芽孢杆菌为肠道益生菌,且具有较强的蛋白酶活性 而受到极大关注。该文对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的特性与应用、提高枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力的途径以及枯草芽孢杆菌中性 蛋白酶的分离纯化方法进行了综述,并对存在的问题进行了分析与展望,旨在为枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的深入研究提供参考。     

^60Coγ—DES复合诱变选育高产中性蛋白酶枯草杆菌及其发酵工艺研究

由一株枯草芽孢杆菌作为出发菌株,通过^60Coγ—DES（^60Coγ-硫酸二乙酯）进行物理化学复合诱变,采用平板酪蛋白水解圈法初筛,摇瓶复筛后,得到一株活力较出发菌株产酶活力增大44．5％的突变株。研究了发酵工艺参数对该突变菌体生长及产酶的影响,并确定了接种量1％,最佳初始pH为7．0,发酵温度为30℃的发酵工艺条件,结果证实,经过优化,可以获得较好的酶活,平均产酶能力可达到2135．43U,较原始菌株提高了59．60％。     

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化研究

采用酰胺交联法将葡萄糖酸冼必泰修饰在载体上,并优化了修饰后的载体对中性蛋白酶的结合条件及催化活性的影响。结果表明,葡萄糖酸冼必泰对载体的修饰条件及修饰后的载体对中性蛋白酶的固定条件为:葡萄糖酸冼必泰的添加量为0.095 mmol、树脂活化时间为1 h、载体羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)摩尔比为1∶3、中性蛋白酶的添加量为600 U,酶活化时EDC的添加量为13.7 mg。在此条件下,固定化中性蛋白酶的酶活性可达398U/g树脂。经傅立叶红外分析,枯草芽孢杆菌中性蛋白酶成功的交联到修饰有亲和配基的亲和树脂载体上。经过固定后,固定化酶的米氏常数K_m值为2.9 mg/mL,游离酶的K_m值为1.7 mg/mL,随意固定化酶的K_m值为7.1 mg/mL。     

脉冲磁场诱变结合发酵条件优化提高 中性蛋白酶产量的研究

利用脉冲磁场诱变枯草芽孢杆菌结合发酵条件优化以实现中性蛋白酶产量的最大化。结果表明在磁场强度为7 T,脉冲数为40次时诱变得到了中性蛋白酶产量提高17.7%的枯草芽孢杆菌菌株。对其发酵条件进行优化,得到最佳发酵培养基配方为豆粕粉90 g/L,麦芽糖10 g/L,KH_2PO_4 8 g/L,最佳发酵条件为接种量5%、发酵温度37℃、摇床转速180 r/min。在此条件下,发酵48 h,中性蛋白酶酶活力为384.57 U/m L,比野生株提高了26.48%。     

中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。     

枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化

通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化,达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的。结果表明,发酵培养基的最佳组分：添加麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h,酶活力由最初的98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。     

枯草芽孢杆菌B.subtilisML中性蛋白酶基因的克隆及鉴定

以蛋白酶高产菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＬ为供体菌，提取其染色体ＤＮＡ，经限制性内切酶ＢａｍＨＩ完全酶切后，插入枯草杆菌载体ｐＮＱ１２２的相同酶切位点，连接后转化中性碱性蛋白酶基因双缺陷型菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。从含有氯霉素的酪蛋白平板上获得了２０个具有蛋白酶活性的克隆。     

高产中性蛋白酶菌株的诱变选育及益生特性

以产中性蛋白酶的枯草芽胞杆菌WT为出发菌株,通过理化诱变来筛选高产菌株,并检测高产菌株耐热、耐模拟胃肠液、表面特性、降脂能力和对几种致病菌的抑菌能力来评价其益生特性.以紫外、LiCl为诱变剂,通过3轮诱变后,得到了1株能稳定高产中性蛋白酶的突变菌株UL-191,其中性蛋白酶活力较出发菌株WT提高了44.2％,达108....     

弹性蛋白酶产生菌的化学诱变选育

从湖北工业大学巡司河附近的土壤和污水中采集到的3个样品，经富集培养，分离到14株能产生弹性蛋白酶的菌株，反复初筛、复筛后，分离到一株产胞外弹性蛋白酶较高且稳定的细菌，经初步鉴定属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilia）。该菌的生长温度为37℃，属革兰氏阳性菌，要求培养基的pH为7．0，对该菌进行化学诱变，诱变剂选用硫酸二乙酯（DES）。诱变处理后绘制致死曲线。诱变浓度为1％，诱变时间为50min时，该菌的致死率迭到77．5％。在此诱变剂量下，选透明圈直径与菌落直径之比最大的菌落进行酶活测定，在波长为495nm同一稀释倍数下，诱变前该菌酶活为74．25U／mL。诱变后的酶活为98．55U／mL，较出发菌株提高了33％。     

益生菌纳豆芽孢杆菌的筛选

益生菌克服了非营养性添加剂特别是抗生素带来的负面效应,它是无污染、无残留、抗疾病、促进动物生长的天然添加剂,在饲料工业中得到了广泛的应用.本文以豆豉为原料,分离鉴定出了KT-1,KT-4,KT-9和KT-14四株纳豆芽孢杆菌菌株,同时依据菌株在使用过程中应具备的几个基本条件,从四种菌株中筛选出了对温度、pH、抗生素有较强耐受性;对病原菌有强抑制能力和对有益菌有良好共生能力;同时又具有较好产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶能力的优良益生菌纳豆芽孢杆菌菌株KT-9.     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

枯草芽孢杆菌产原果胶酶发酵条件研究

原果胶酶(Protopectinase)是可以催化原果胶水解的酶类,广泛用于果胶生产、单细胞食品制备和棉织品的生化精炼之中。实验对影响枯草芽孢杆菌XZ2(BacillussubtilisXZ2)摇瓶发酵生产原果胶酶的相关因子:豆粕粉的水提时间、水提液浓度、磷酸盐浓度、金属离子、发酵培养基初始pH值、接种量和接种龄等采用单因素试验进行了研究,在单因素试验基础之上,选取pH、接种量、Mg2 、磷酸盐和转速等因素进行正交试验,结果表明发酵培养基初始pH和磷酸盐缓冲液浓度对产酶影响显著。当发酵初始pH7.5,接种量10%,MgSO4·7H2O0.04%,磷酸盐缓冲液浓度为0.20mol/L,摇床转速为120r/min的摇瓶发酵条件下,产酶酶活最高为16.71U/ml。     

枯草芽孢杆菌ls-45发酵法制取玉米肽的研究

经过单因素试验和响应面综合试验,确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ls-45发酵生产玉米多肽的最佳发酵条件:接种量12%,40目玉米蛋白粉,底物浓度5%,初始pH 8.0,装液量100 mL/500 mL三角瓶,培养温度41℃,摇床转速180 r/min,发酵时间63 h.在此条件下玉米肽得率达到最大为82.7%.并对制得的玉米肽进行了初步的分离纯化,经截留分子质量10~4u的中空纤维柱超滤,得到分子质量在10~4u左右的超滤液,其回收率为86.3%,超滤液经SephadexG-25柱分离纯化和相对分子质量分布的测定,共洗脱出4个峰,其玉米肽各级分的相对分子质量分别大致为5128、3715和1513.     

枯草芽孢杆菌发酵制备玉米肽－葡萄糖螯合物的条件优化

以玉米肽和葡萄糖为底物,利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ls-45为菌种发酵,以DPPH清除率为指标,通过单因素及响应面实验优化枯草芽孢杆菌发酵制备玉米肽-葡萄糖螯合物的条件,为研究玉米肽-葡萄糖螯合物体内、体外抗氧化等功能实验提供数据支撑。采用四因素三水平响应面实验确定最佳接种量、pH值、发酵温度及发酵时间。结果表明:利用枯草芽孢杆菌发酵制备玉米肽-葡萄糖螯合物的最佳工艺条件为接种量10%,发酵时间46 h,pH 6,发酵温度37℃,此时DPPH清除率为90.82%。     

枯草芽孢杆菌生产大豆多肽溶液的加工功能特性研究

枯草芽孢杆菌B.s.Shi HeziⅢ发酵豆粕粉产生多肽溶液。不同发酵时间的多肽溶液有着不同的加工特性。水解度DH随着发酵时间的延长而上升；可溶性氮指数(NSI)与发酵时间和pH值均有关，总体上发酵时间越长，NSI越大，pH值在中性条件下NSI较高；浊度受pH值影响，pH值越低，浊度越高，36h的多肽溶液在pH3．0～7．0范围内，浊度较低；多肽溶液均有着较好的乳化性，但乳化稳定性较差。     

枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质的发酵条件优化研究

采用Plackett-Burman设计法,对影响枯草芽孢杆菌抗菌WL17活性物质的6个因素进行筛选,分析结果表明,初始pH、装液量、碳氮比为影响抑菌圈大小的3个关键因子.运用最陡爬坡试验法逼近最佳响应面区域,在此基础上,采用响应曲面法对其3个显著因子的最佳水平范围进行研究,确定上述3个因子的最佳水平为初始pH 6.91、装液量47.59 mL/250 mL、碳氮比2.22.拟合试验模型结果显示,抗菌活性类物质抑菌圈直径的大小从未优化前的16.8mm提高到23.14 mm,抑菌圈大小增加37.7％.     

ARTP诱变联合抗生素抗性选育纳豆激酶高产菌株

为获得产纳豆激酶(nattokinase,NK)活力增强的菌株,以纤维蛋白平板法测得酶活力值为判定指标,采用常压室温等离子体诱变系统(ARTP)对枯草芽孢杆菌XZI125进行诱变,通过酪蛋白平板法和利福平、卡那霉素、链霉素、氯霉素四种抗生素抗性筛选法获得高产NK突变菌株。结果表明,经6轮摇瓶发酵验证,获得了3株遗传稳定的高产突变菌株A27,Ar41和Ac35,摇瓶发酵5 d的产酶活力分别比原始菌株(2490 IU/mL)提高了23.0%、25.1%、26.5%。比较酪蛋白平板筛选方法和0.7 μg/mL利福平、50 μg/mL卡那霉素、60 μg/mL链霉素、300 μg/mL氯霉素四种抗性筛选方法,抗生素抗性筛选方法更有利于NK高产菌株的筛选。     

枯草芽孢杆菌Tpb55抗菌蛋白纯化特性分析

枯草芽孢杆菌Tpb55分离自烟草叶围,对烟草赤星病菌具有较强的拮抗能力。除去菌体培养液以90%饱和度硫酸铵沉淀所得的拮抗粗提液对热稳定,在pH为5.0～10.0范围内较稳定,对木瓜蛋白酶,蛋白酶K,胃蛋白酶不敏感。粗提液经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75(1.6 cm×80 cm)凝胶层析,纯化出一种抗菌蛋白,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白分子量测定,该抑菌蛋白分子量约为47.8 kD,自动Edman降解法从Bst1N端测得的氨基酸序列为:Met-Glu-Ile-Phe-Lys-Tyr-Met-Glu-Thr-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Gln-Leu-Val-Phe-Cys-。     

紫外诱变选育高产蛋白酶枯草芽孢杆菌

紫外线辐射是目前最为广泛的物理诱变因子之一,其引起菌体DNA结构变化的形式很多,如DNA链的断裂、碱基的破坏等,但最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,阻碍碱基间的正常配对,从而引起微生物突变或死亡.以实验室保存的枯草芽孢杆菌为出发菌株,利用紫外诱变的方法,以获取可高效发酵生产蛋白酶的突变株.通过大量筛选及连续传代实验,确定了一株突变性状能稳定遗传的突变株,其蛋白酶产量较出发菌株有大幅度提高.