胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达的启动序列ISRE4(4个串联的ISRE序列)和GAS7(7个串联的GAS序列),与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-EnhancerGAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达

对造血调控中发挥重要作用的IKAROS基因亚型IK4进行突变,并构建重组逆转录病毒表达载体及使其在白血病细胞中表达。采用重叠延伸PCR定点突变技术,成功构建了4个IK4单突变或多突变突变体。将这4个突变体克隆至Pmscvpuro逆转录病毒载体中,构建重组蛋白表达载体。基因测序验证突变序列正确后,将重组逆转录病毒载体与病毒包装质粒VSVG、Gag-Pol共同感染293T细胞,过滤收集病毒上清,将病毒上清转染白血病NB4细胞。用Puromycin对细胞进行筛选,并通过Western印迹法对突变体表达细胞系进行验证。通过重叠延伸PCR法成功构建了4个IK4的定点单突变和定点多突变体,利用逆转录病毒介导的转染方法使IK4的4个突变体在白血病细胞中成功稳定表达,为后续的功能和机制的研究奠定了基础。     

Chk1/2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定

目的构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础。方法参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%,Chk2基因的同源性为99%,编码的氨基酸同源性为100%。G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcD-NA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞。经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加。结论成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础。     

肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌的实验研究

目的:探讨肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌的疗效。方法:根据GenBank中Surivivin基因序列设计引物,在上下游引物5’端引入相应酶切位点,以Hep G2基因组DNA为模板扩增Surivivin启动子基因片段。体外合成最小polyA转录中止信号,以p SUPER.retro.puro载体为媒介构建新的干涉载体pS-surP-shRNA-mpA(p S/sur P),完成干涉靶点的选取并完成干涉载体的构建和鉴定;建立细胞培养和转染及稳定转染细胞系,完成FAK RNAi的干扰效应性检测,进行体外细胞增殖及凋亡实验。结果:重组质粒完成DNA提取后,PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳后获得1条预期大小的特异性皮带,质粒Surivivin启动子调控的FAK shRNA涉及符合要求。将目的片段与肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA慢性载体表达载体连接的阳性克隆序列,获得DNA序列证实含有目的序列片段,提示质粒构建成功;PCR仪结果显示:Surivivin启动子调控的FAK shRNA在肝癌细胞中表达水平较低,抑制率能达到73.33%;Western blotting法结果显示:转染后,与未转染的HepG2细胞相比,转染后肝癌细胞Surivivin含量明显下降;流式细胞仪结果表明:细胞转染后,肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA细胞凋亡率为24.39%,与未转染细胞的4.12%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌可明显抑制肿瘤细胞的增殖,控制肿瘤的侵袭与转移。     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

SCN3A基因突变型表达载体的构建及在HEK 293细胞中的表达

目的体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV_6-XL_4-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G),为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物,以野生型质粒为模板进行定点诱变,构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中,24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后,RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A基因突变型真核表达载体pCMV_6-XL_4-SCN3A-N302S,并在基因水平上验证了能在HEK293细胞中表达。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础。方法从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定。结果获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1（1.5 kb）基因,序列分析结果与PAO1/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA（1.2 kb）片段相符。结论含mexA（1.2 kb）基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础。