响应面法优化酶法制备驴血红蛋白源二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽

食源性二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制活性肽成为近年来健康产品研究的方向之一.本研究以驴血红蛋白为原料,采用计算机模拟蛋白水解方法筛选最佳蛋白酶,研究酶解时间、温度和加酶量对蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)和酶解产物DPP-Ⅳ抑制率的影响,响应面优...     

核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及稳定性研究

采用5种商业蛋白酶水解核桃粕,评估水解物对二肽基肽酶4（DPP-Ⅳ）的抑制活性,优选出碱性蛋白酶作为水解用酶。研究确定了碱性蛋白酶水解核桃粕的最佳水解时间为5 h,然后通过超滤和SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱层析分离纯化碱性蛋白酶水解物得到核桃蛋白DPP-IV抑制肽,并对所得DPP-IV抑制肽的热稳定性、pH稳定性和模拟胃肠道消化稳定性进行了测试。结果表明,核桃蛋白DPP-IV抑制肽（025 mg/mL）DPP-Ⅳ抑制率（76.19%）比未分离纯化的水解物的提高了约3倍,其富含碱性氨基酸（含量34.36%）,尤其是精氨酸含量高达25.93%。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽在高温（121 ℃）、极端pH（pH 1.0和pH 11.0）和模拟胃肠道消化条件下,均显示出良好的稳定性,因此可用作控制血糖的功能性食品成分。     

基于In Silicon模拟消化的北极虾DPP-Ⅳ抑制肽活性分析

北极虾具有很高的营养价值,在食品领域已引起越来越多的关注。对北极虾蛋白进行In Silicon模拟消化获得寡肽,通过PeptideRanker活性评分及理化性质分析,从中筛选出具有潜在生物活性的寡肽。使用ToxinPred分析和BIOPEP-UWM生物活性预测,发现部分寡肽具有二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制活性,最终确定WFP（一种三肽,Trp-Phe-Pro）具有最优的DPP-Ⅳ抑制活性肽。分子对接表明,WFP和DPP-Ⅳ能够形成稳定的复合物,其结合能为-6.93 kcal/mol,进一步研究表明,WFP通过与DPP-Ⅳ S1、S2、S3三个活性口袋中的9个氨基酸残基发生相互作用而抑制其活性。本研究为阐释北极虾营养价值及生物活性肽的开发提供了理论依据。     

酪蛋白非磷肽中一种ACE活性抑制肽的分离和鉴定

酪蛋白经碱性蛋白酶Alcalase水解后,加入乙醇提取出的酪蛋白非磷肽(CNPPs)对血管紧张素转化酶(ACE)的活性有很强的抑制作用。采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15和反相高效液相色谱(RP—HPLC)对CNPPs进行分离纯化,通过高效液相色谱/电喷雾电离质谱联用分析和氨基酸组成分析鉴定出一种抑制ACE活性肽,其氨基酸序列为Ser-Trp,ACE半抑制浓度为92.8μmol/L。     

酶法糖基化修饰对酪蛋白体外消化能力的影响

利用转谷氨酰胺酶（transglutaminase,TGase）催化制备壳寡糖（1 kDa）糖基化酪蛋白;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和反相-高效液相色谱证实糖基化修饰反应的发生;体外消化实验（胃蛋白酶＋胰蛋白酶）分析糖基化修饰反应对酪蛋白消化性的影响。结果表明：TGase成功催化壳寡糖连接到酪蛋白分子上,所制备的糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的导入量为6.86 g/kg;糖基化酪蛋白经体外模拟消化后,其水解度和三氯乙酸可溶性氮均低于酪蛋白对照物,糖基化酪蛋白消化物中出现了更多大分子质量的肽段,研究表明TGase途径糖基化修饰降低了酪蛋白的体外消化能力。     

仿刺参胶原蛋白源二肽基肽酶抑制肽虚拟筛选及分子对接研究

目的 采用生物信息学和分子对接方法筛选仿刺参胶原蛋白来源的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽。方法 以仿刺参胶原蛋白序列为对象,进行生物信息学分析和计算机辅助虚拟酶解,基于生物毒性、致敏性、水溶性及吸收、分配、代谢、排泄及毒性(absorption,distribution,metabolism,excretion,toxicity,ADMET)预测,筛选得到6条具有潜在生物活性的寡肽,氨基酸序列分别为CD、CQ、CS、GR、SM、MDG,进一步通过分子对接分析肽段与DPP-Ⅳ的结合活性,并分析其结合位点及方式。结果 生物信息学分析表明仿刺参胶原蛋白是生物活性肽的潜在优良来源,经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及模拟胃肠道虚拟水解后能够释放出DPP-Ⅳ抑制肽;分子对接表明俩条新肽段CS、SM通过氢键、疏水相互作用分别与DPP-Ⅳ的S1、S2活性口袋结合。结论 本研究提供了一种快速筛选刺参胶原蛋白中DPP-Ⅳ抑制肽的方法。     

辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽

基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,液相色谱-串联质谱法研究辣木凝乳酶对酪蛋白的酶切位点和水解特性,并分析该凝乳酶水解产生的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽。结果表明,辣木凝乳酶酶切κ-酪蛋白的Arg 93-His 94位点导致凝乳,区别于其他已报道的凝乳酶,具有明显特异性。酶作用下κ-酪蛋白的米氏常数Km=0.49 mg/mL,最大反应速率Vm=45.2 U/min,有效促进酪蛋白胶束的聚集和凝乳。该酶对α-、β-、κ-酪蛋白产生不同程度的水解,对α-酪蛋白的水解速度最快,说明其适用于软质奶酪的加工。以酪蛋白为底物,通过钡-乙醇沉淀法得到酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,CPPs）,产率为15.87%,得到的CPPs可以使钙沉淀推迟23 min,有利于钙离子被肠道有效吸收。以水牛乳为底物时,乳凝固后析出的乳清中含酪蛋白糖巨肽6.61 mg/mL,糖基化程度477.527 μg/mg。研究为新型植物凝乳酶的研发,及其在奶酪、酪蛋白活性肽等产品的应用提供科学依据。     

阿胶活性肽的结构鉴定及活性筛选

利用液相色谱-串联质谱联用技术鉴定阿胶模拟胃肠道消化产物中肽的结构,并通过分子对接技术从中筛选潜在的降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤的活性肽。结果表明,从阿胶消化产物中获得519 种活性肽,其分子质量在661.4～2 851.4 Da之间,主要为胶原蛋白和血红蛋白的酶解产物;获得最具潜力的降血压肽KGETGLR、抗老年痴呆肽SGLDGAKG和抗肿瘤肽ADGVAGPK;氢键相互作用和静电相互作用在阿胶肽发挥降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤活性中都起着重要的作用。     

大鼠肠囊外翻法分析核桃肽吸收特性及抗氧化肽筛选鉴定

本研究通过大鼠肠囊外翻法探讨了<3 kDa核桃蛋白肽模拟胃肠消化产物的吸收特性,以抗氧化能力(DPPH自由基清除率、ABTS⁺自由基清除率、Fe²⁺螯合率)和活性肽吸收率为指标筛选核桃肽在肠道吸收的最优条件,并应用模拟分子对接技术和Nano-HPLC-MS/MS技术对吸收肽组分进行筛选和鉴定,得到能够以完整形式被吸收并发挥抗氧化活性的新型核桃源肽。结果表明:当核桃肽消化产物吸收浓度为6 mg/mL,吸收时间为2 h时,其抗氧化活性最高且在小肠吸收率最高:进一步通过Nano-HPLC-MS/MS鉴定结果表明0.5～1 kDa活性肽数量最多,其中位于C端/N端氨基酸主要集中在Pro、Thr、Leu,鉴定出33条活性肽能够以完整形式被吸收,穿过肠道屏障;最后通过分子对接技术与DPP-Ⅳ相结合,获得三条结合能最低的活性肽NLRFPL、NPDDEFRPQ、KGHLFPN,其结合能分别为-8.8、-8.6、-8.6 kal/mol,其中KGHLFPN抗氧化能力最强。综上,<3 kDa核桃肽模拟胃肠道消化能够释放抗氧化活性更高且能够被小肠吸收的...     

酪蛋白水解物中ACE抑制肽分离及氨基酸序列分析

以牛乳酪蛋白为底物,先经胃蛋白酶水解,再经胰蛋白酶水解,从水解物中分离获得血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽并确定其氨基酸序列。酪蛋白的双酶水解物经超滤和葡聚糖凝胶色谱分离,分离得到3 个组分,收集高ACE活性抑制效果组分Ⅱ和Ⅲ。采用离子色谱法分析水解片段的氨基酸组成,液相色谱-质谱法分析水解片段的氨基酸序列,采用固相合成法制备获得的短肽片段,用分光光度法检测ACE活性抑制效果。结果表明,组分Ⅱ包含缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸,共8 种氨基酸,组分Ⅲ包含痕量的丝氨酸和酪氨酸;将组分Ⅱ和Ⅲ经液相色谱-质谱分析,获得8 个片段,其中,αs2-f（56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用,其IC50值分别为11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。     

花青素对大豆蛋白体外胃消化结构的影响

利用胃蛋白酶对大豆分离蛋白-花青素复合物进行体外模拟消化,研究消化过程中花青素对蛋白水解度、结构、亚基组成及分子质量分布等指标的影响。结果表明：大豆分离蛋白在30?min内消化较明显,蛋白对照组最终水解度高达48.5%,花青素的添加一定程度抑制了蛋白消化。花青素抑制11S球蛋白消化,促进7S球蛋白主要致敏原α-亚基降解,因而推测花青素添加有降低大豆蛋白食用致敏性的效果。排阻色谱分析表明,体外消化将大分子蛋白水解为小分子肽,花青素的添加抑制了小分子肽的形成,最终产物分子质量分布主要集中在3～100?kDa。圆二色谱图显示,花青素改变了大豆蛋白构象,α-螺旋含量降低,β-折叠及无规则卷曲含量增加,β-转角变化无明显规律。荧光光谱分析表明,花青素添加使蛋白及消化产物λmax发生红移,并对蛋白产生了荧光猝灭作用。本研究明晰了蛋白与花青素同食过程中大豆蛋白的解离机制,并为食品生产加工领域制备易消化、高吸收、低致敏的优质蛋白产品及营养膳食搭配方式提供理论指导。     

牦牛乳硬质干酪体外消化前后ACE抑制肽分析

以牦牛乳硬质干酪为原料,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟体外肠胃道消化的方法,运用毛细管液相色谱结合Quadrupole-Orbitrap质谱,对牦牛乳硬质干酪体外消化前后血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽活性和其肽特征进行了分析。结果表明:牦牛乳硬质干酪鉴定出ACE抑制肽15种,经胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后,其ACE抑制肽为12种。ACE抑制肽主要源自β-酪蛋白,分子质量为800～1 500 Da。相同ACE抑制肽3种。18种ACE抑制肽共享了已知ACE抑制肽C-末端的三肽氨基酸结构,大多数ACE抑制肽具备了抑制ACE活性的结构特征,它们是潜在ACE抑制肽。干酪中SKVLPVPQ、QEPVLGPVRGPFP、YQEPVLGPVRGPFPI和干酪消化后LVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPN、YQEPVLGPVR确定具有ACE抑制活性。干酪水溶性多肽与其经胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的酶解物的ACE抑制活性间无显著性差异(P> 0.05),这为开发具有保健功能特性的牦牛乳硬质干酪提供了理论依据。     

甲鱼蛋α-葡萄糖苷酶抑制肽及其纳米运载体的体外胃肠消化特性

以甲鱼蛋α-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK为研究对象,评价胃肠消化对SGTLLHK抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响;采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱分析SGTLLHK的消化特性及其产物;最后通过制备牛乳外泌体和固体脂质纳米颗粒（solid lipid nanoparticles,SLN）包埋SGTLLHK,测定颗粒特征（微观结构、Zeta电位、粒径、多分散性指数（polymer dispersity index,PDI））,并利用高效液相色谱考察包埋率及在胃肠道环境下的稳定性。结果表明：经胃消化后原肽SGTLLHK完全被降解,从消化产物中共鉴定到2 条肽段（SGTLL、GTLL）;进一步经肠消化后GTLL被完全降解,仅剩产物SGTLL。SGTLLHK的α-葡萄糖苷酶抑制活性在胃消化后显著上升,而在肠消化后显著下降,且低于原肽的抑制能力。SGTLLHK被成功包埋于外泌体、SLN中,其中外泌体包埋体系具有高度稳定性（粒径（125.87±2.66）nm,PDI 0.17±0.01）,经胃肠消化后,SGTLLHK-外泌体颗粒体系保留率为72.52%,SGTLLHK-SLN保留率为48.43%,表明两者均能保护大部分原肽不被胃肠消化酶降解,且外泌体的保护作用优于SLN。     

克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中ACE抑制肽的分离纯化与鉴定

为了从克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,以克氏原螯虾虾头为原料,采用体外模拟肠胃道消化的方法对其进行酶解,以体外ACE抑制率为指标,通过超滤、凝胶色谱、离子色谱、反向高效液相色谱相结合的方法对克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物进行分离纯化与筛选,以期获得纯度较高的ACE抑制肽,并利用电喷雾静电场离子阱串联质谱对其氨基酸序列进行测定,结果表明,克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中ACE抑制肽主要分布在分子质量低于3 000 u的超滤组分中;经过分离纯化鉴定得到1个新型ACE抑制肽,其分子质量为225 u,肽序列为Pro-Val,半数抑制浓度IC50值为0. 11 mg/m L,与模拟消化产物相比,ACE抑制肽的IC50值纯化了16. 72倍。     

覆盆子单宁富集组分消化稳定性及对肠道菌群的调节作用

单宁类化合物是覆盆子的主要活性成分,具有降血糖、降血脂、抗炎、延缓衰老及预防心脑血管疾病等功能。本实验从覆盆子中提取富集单宁,通过体外模拟消化模型探究覆盆子单宁富集组分消化前后单宁含量及抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性变化,通过体外厌氧发酵模型分析模拟消化对其肠道菌群调节作用的影响,最后采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flighttandem mass spectrometry,UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）比较体外消化和酵解产物中单宁组成及其代谢产物含量变化情况。结果表明,在胃、肠消化过程中水解单宁含量均呈先增加后降低趋势,胃肠消化提升了覆盆子单宁富集组分的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力（半抑制质量浓度为29.15～39.65μg/mL）,但对2,2’-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除能力无显著性影响（P>0.05）,经肠道模拟消化后,样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力提升了7.16～7.86...     

酶解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究

目的利用酶技术制备酪蛋白源ACE抑制肽.方法以ACE抑制活性为指标,筛选最佳用酶,优化酶解反应条件,并研究酶解过程中水解度和游离氨基酸含量的变化.结果通过对5种蛋白酶的筛选,最终确定AS1.398中性蛋白酶为水解用酶,制备酪蛋白源ACE抑制肽,其最佳反应条件为pH 7、温度45℃、底物质量分数7.5%、酶用量([E]/[S])5%,水解6 h.在酶解过程中,随着时间的延长,水解度略有增加,而游离氨基酸含量大幅度增加.酪蛋白ACE抑制肽的半抑制浓度(IC50值)为0.68mg/mL.结论牛乳酪蛋白用蛋白酶水解可制备高活性的ACE抑制肽,是获得ACE抑制肽的良好来源.     

牛乳酪蛋白体外模拟消化液的ACE抑制活性及其肠道吸收

本文对牛乳酪蛋白进行体外模拟消化,以ACE抑制活性为指征,LC-MS/MS确定水解物肽谱,并采用大鼠肠道模型对其吸收进行初步研究。结果为人工胃液消化、人工肠液消化、胃肠联合消化三种消化方式的水解度均随时间的延长而增大,单胃和单肠消化的ACE抑制率均随水解时间的延长先快速增加,随后逐渐降低,而胃肠联合的ACE抑制率则是先降低再增加,胃肠联合消化产生水解度最高为25.51%,其ACE抑制率在2 h时达到最高值为68.03%;LC-MS/MS测定消化液的肽谱,分析得出模拟消化后可能产生的ACE抑制肽有IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK;使用FITC标记酪蛋白进行体外模拟消化,SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE都表明FITC-酪蛋白经过胃肠消化后荧光标记稳定存在,且水解物的分子量在5 ku以下;大鼠肠道吸收模型发现标记后的牛乳酪蛋白经模拟消化后在肠道吸收率大小依次为十二指肠吸收空肠吸收回肠吸收结肠吸收,主要在十二指肠吸收。     

RP-HPLC法测定酪蛋白水解物中ACE抑制肽的含量

目的:为了建立定量检测酪蛋白水解物中的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法。方法:酪蛋白先经过胃蛋白酶水解、再经过胰蛋白酶水解,用风味蛋白酶和离子交换树脂对水解物先后进行脱苦和脱盐处理。建立标准品十肽酪氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸(YQKFPQYLQY)的RP-HPLC检测方法,运用外标法测定酪蛋白水解物中的ACE抑制肽YQKFPQYLQY的含量。结果:标准品十肽YQKFPQYLQY质量浓度在2.5~4.5mg/m L(R2=0.95496)范围内与峰面积呈良好的线性关系。酪蛋白水解物中所含十肽质量分数为4.96694%±0.00131%。结论:本液相检测方法操作简便、快速,适用于ACE抑制肽YQKFPQYLQY的定量检测分析。     

枯草杆菌蛋白酶水解对大豆蛋白肽谱变化规律的影响

该研究针对芽孢菌来源的枯草杆菌蛋白酶对大豆蛋白的水解过程,探究过程中形成肽谱的变化规律。使用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱检测不同时间点的水解多肽,基于非特异性酶切肽谱鉴定方法,解析多肽序列和组成,展示肽谱的动态变化特征和氨基酸位点种类选择的倾向性。结果发现,枯草杆菌蛋白酶更倾向于酶切大豆蛋白中组氨酸C 端、天冬酰胺C 端、丙氨酸N 端和苏氨酸N 端的肽键。     

花生分离蛋白水解物中血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化与结构鉴定

利用碱性蛋白酶Alcalase对花生分离蛋白进行水解,制备花生分离蛋白水解物,并测定不同水解时间所得产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。未水解的花生分离蛋白没有ACE抑制活性,而利用碱性蛋白酶Alcalase水解所得的水解物具有很强的ACE抑制活性,水解30 min时水解物活性最高,其半抑制浓度为(IC50)0.56 mg/mL。通过超滤、Sephadex G-15凝胶过滤层析、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)和氨基酸组成分析等分析手段从水解30 min所得的水解物中分离鉴定出两种新的ACE抑制肽,氨基酸序列为Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser,其IC50值分别为10.6μmol/L和36.6μmol/L。