双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

采用活泼酯法将双酚A的结构类似物双酚酸与载体蛋白偶联制备人工抗原,用制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法进行细胞融合制备双酚A单克隆抗体,成功获得一株分泌抗双酚A单克隆抗体的细胞株3H1,经鉴定抗体属于IgG1亚型,轻链为κ,并建立了间接竞争酶联免疫分析法。线性范围为1～50 ng/mL,最低检测限为0.43 ng/mL,半数抑制浓度为6.56 ng/mL。回收率为82.83%～101.94%,变异系数为2.94%～12.95%。该方法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)单克隆抗体,以50μg/只的免疫剂量将KTI免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和敏感性,选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到稳定分泌KTI单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为157.33ng/mL,经细胞融合筛选得到4E6-E9阳性杂交瘤细胞株,所制备的抗体效价达到11 638 400,亚型为IgG1型,亲和常数为1.45×108 L/mol,IC50为28.39ng/mL,且特异性强。说明试验所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立灵敏、特异的KTI免疫学检测方法提供良好的抗体保障。     

大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子（BBI）单克隆抗体（mAb）,以50 μg/只的免疫剂量将BBI免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA试验鉴定多抗血清效价和敏感性。选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到分泌BBI mAb的稳定杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备BBI mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明：1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度（IC50）为868.58 ng/mL。经细胞融合筛选得到5株杂交瘤细胞,其中3B7-B10 mAb效价达到1 ∶ 4.096×105以上,亚型为IgG1型,IC50为83.07 ng/mL,具有亲和力较高且特异性强的优点,表明所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立大豆及其制品中BBI的免疫学检测方法提供良好的抗体基础。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法.以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2.经鉴定,两个抗体亚类都为IgG,,其腹水纯化后效价分别达到2.56 ×105和1.28 ×105.以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4.76～84.99ng/mL,IC50为20.12ng/mL,检测限为3.25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253.62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应.本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒.     

磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定

采用重氮法同时制备结合比分别为9.0、8.0、3.7 的3 种磺胺嘧啶免疫抗原,并将其免疫BALB/c 小鼠,其中结合比为8.0 的一组免疫效果最佳。获得一株稳定分泌抗磺胺嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞(1F6),体内诱生法制备腹水。间接ELISA 测定腹水效价为1:1.28 × 106,建立间接竞争ELISA 标准曲线,其检测下限为10.4ng/mL,线性范围为14.8～421.5ng/mL,IC50 值为79.1ng/mL,与磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶交叉反应率分别为 0.3%、0.99%、4.5%,与磺胺甲噁唑、磺胺喹恶啉、对氨基苯甲酸、磺胺、对氨基苯磺酸未见有交叉反应。经鉴定,单克隆抗体免疫球蛋白为鼠IgG 的2b 亚类。     

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA 检测

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原,用所制备的人工抗原免疫BALB/c 小鼠,采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体,结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体,经鉴定为IgG2a 型,并建立间接竞争ELISA 检测方法,线性范围为0.5～10ng/mL,检测下限为0.1ng/mL,加标回收率为52.3%～110%,变异系数为3.2%～8.9%。     

花生致敏蛋白Ara h 3单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

以Ara h 3为免疫原免疫小鼠。选取血清效价高的小鼠再次免疫，制备出脾细胞后与骨髓瘤细胞一起进行细胞融合，得到杂交瘤细胞株，筛选阳性株制备大量单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对制备的单克隆抗体进行效价测定、敏感性测定和特异性测定。通过蛋白质免疫印迹试验进一步验证其特异性。结果表明：免疫性较好的4B2单克隆抗体经纯化后的效价为1∶5.12×10⁵。由敏感性测定得知4B2单克隆抗体的半抑制浓度(IC₅₀)为389 ng/mL,证明其具有较好的敏感性，交叉反应率小于0.5%,成功制备出纯度高、效价高、敏感性好、特异性强的Ara h 3鼠源单克隆抗体，为建立免疫学快速检测方法奠定了基础。     

恩诺沙星快速酶联免疫吸附法检测试剂盒的研制

目的：研制恩诺沙星酶联免疫吸附法检测试剂盒。方法：采用EDC-NHS 法制备ENR-M-BSA 免疫原和ENR-OVA 检测抗原,用ENR-M-BSA 免疫BALB/C 小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法筛选单克隆抗体并采用间接竞争ELISA 对其进行分析。结果：通过公式计算ENR-M-BSA 摩尔偶联比为15:1,ENR-OVA 摩尔偶联比为7.2:1。筛选出1 株特异性分泌株3E9,其腹水纯化后间接竞争ELISA 测其效价为107,分型试剂盒测试显示此抗体属于IgG1 型;检测限为1ng/mL,线性范围在1～100ng/mL 之间,半量抑制浓度(IC50 值)为10ng/mL,与4 种结构类似物交叉反应均小于1%。结论：此株单克隆抗体可以用来建立恩诺沙星ELISA 检测试剂盒。     

半抗原直接包被的四环素酶联免疫吸附分析法的建立

为建立更优的四环素（tetracycline,TC）酶联免疫吸附分析法（enzyme?linked immunosorbent assay,ELISA）,将TC 与蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c 小鼠,获得抗TC 的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）。采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将TC 直接包被在酶标板上,并对ELISA 反应体系条件进行优化,构建一种半抗原直接包被的TC ELISA 检测方法。所制备的MAb 特异性良好,交叉反应率低。所构建的检测方法最低检测限IC10 值为0.306 ng/mL,半数抑制率IC50值为9.26 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为96.46%～101.89%、96.84%～102.50%。与人工完全抗原包被的检测方法相比（IC10值：0.624 ng/mL,IC50值：28.24 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为93.86%～105.12%、94.04%～105.56%）,检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中TC 含量的检测,具备良好的应用前景。