氟甲喹胶体金免疫层析试纸条研究

选择氟甲喹(FLU)作为目标物,制备能够特异性识别氟甲喹的多克隆抗体,建立氟甲喹的胶体金标记免疫层析分析方法。胶体金颗粒的粒径为20 nm;金标抗体连接的最佳p H值为8.5、最适抗体量为20μg/m L;捕获抗体的包被浓度为0.5 mg/m L,二抗1∶200倍稀释,选择Milllipore HF135s硝酸纤维膜作为固相载体,金标抗体1∶10稀释喷涂到金标垫上;在最优条件下组装试纸条,将金标抗体铺在结合释放垫上的组装方式其方法检出限为20μg/L;选择鸡肉、牛肉、猪肉、鱼肉、虾肉、猪肝和牛奶7种实际样品进行添加回收试验,样品检出限为50μg/L。     

纳米胶体金的制备及其抗体标记研究

研究通过光谱扫描,确定了柠檬酸钠还原法制备纳米胶体金的最佳条件:100mL0.01%四氯金酸溶液中添加1%柠檬酸钠2mL,反应10min,制备的胶体金粒径为15～20nm,并将其与抗牛β-酪蛋白IgG连接制得了胶体金标记抗体,通过考马斯亮蓝法测得蛋白标记率为74.5%,采用间接ELISA方法测得金标抗体的效价在1∶4000以上,抗体金标后活性良好,可以满足免疫检测的需要。     

胶体金免疫层析技术测定食品中黄原胶

目的:建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测新方法,用于食品中黄原胶的快速筛查。方法:用黄原胶抗原标准品免疫新西兰大白兔,制备得到高效价的抗黄原胶多克隆抗体;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,并将其与抗黄原胶多克隆抗体标记制得金标抗体;在硝酸纤维素膜检测线上,预包被黄原胶标准抗原,质控线上包被羊抗兔IgG,采用竞争法,制成黄原胶胶体金免疫层析检测试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性和稳定性进行了试验。结果:该试纸条检测样品的敏感性为3g/kg。结论:研制出黄原胶胶体金免疫层析试纸条及其检测方法,该方法敏感性高、特异性强、操作简便,5min可出检测结果,可用于现场大量样品的快速检测。     

呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮（AMOZ）单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法。方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原。免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度（IC50）和最低检测限（LOD）,并检测抗体的特异性。胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性。结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD0.07μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应。制备的胶体金试纸条灵敏度5μg/L。结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条。      

胶体金免疫层析捕获法检测人血清中肺炎支原体IgM抗体

采用胶体金标记鼠抗人IgMμ链抗体,肺炎支原体P1抗原作包被蛋白,检测肺炎支原体特异性抗体IgM.经对免疫金制备条件进行优化,制备了胶体金免疫层析检测试纸条.将该试纸条与市售试剂盒作对比检测,总符合率为99.17%,表明本方法灵敏度较高、特异性较强,价格低,操作简便快捷,更适合MP感染患者早期临床筛查.     

胶体金免疫层析法快速检测动物源性食品中土霉素残留

目的 建立用于快速检测动物源性食品中土霉素残留的胶体金免疫层析试纸条.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,胶体金粒径选用20 nm,将经鉴定制备成功的胶体金溶液与土霉素多克隆抗体结合得到金标抗体.优化金标抗体的制备条件,将包被抗原(1.0 mg/mL)和羊抗鼠二抗(0.75 mg/mL)分别作为检测线和质控线包被在硝...     

邻苯二甲酸二甲酯免疫层析快速检测试纸的研制

邻苯二甲酸酯类塑化剂是一类具有生殖毒性的环境激素类物质,通过违规添加或迁移而造成食品污染问题颇为严峻,开发适合现场的塑化剂快速监测方法非常重要。本研究以邻苯二甲酸二甲酯(DMP)为对象,建立了DMP的胶体金标记免疫层析检测试纸方法。采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了胶体金,将其标记DMP多克隆抗体,制备了金标抗体;采用棋盘法和单因素试验确定最佳包被浓度和二抗浓度分别为3000μg/mL和1600μg/mL,抗体浓度为稀释1.4倍,基于此建立了DMP免疫层析快速检测方法,其检测限为0.4μg/mL,5 min内肉眼可观察到检测结果,与其它结构功能类似物无明显交叉反应,特异性良好,白酒样品添加检测结果与GC-MS法相符。本法快速简单,稳定可靠,适用于实际样品中DMP的现场快速检测。     

四环素胶体金免疫检测技术的研究

为研制四环素(tetracycline,TC)胶体金免疫层析试纸条,对胶体金的制备及与四环素多克隆抗体的标记进行研究。采用柠檬酸钠还原法制备胶体金,向加热沸腾的100 mL0.01%氯金酸中加入1.8 mL1%柠檬酸钠,加热15 min后冷却定容;已制备好的胶体金溶液标记四环素抗体,将装有1 mL胶体金的离心管中加入一定量K_2CO_3调节p H值,加入一定量抗体蛋白后4℃条件下反应30 min,加入100μLNa Cl后4℃条件下保存备用,标记成功后优化条件。结果表明,胶体金颜色为紫红色、清亮透明、无沉淀及漂浮物,可见光光谱峰宽较小,证明胶体金大小分布均匀,制备成功;硝酸纤维素膜(NC膜)上有明显红色斑点,可见光光谱中最大吸收峰出现偏移,证明金标抗体标记成功;胶体金标记四环素抗体的最佳p H值为7.5,最佳标记蛋白量为稀释抗体6 000倍。胶体金的制备及与四环素多克隆抗体标记的成功,为装配四环素胶体金试纸条奠定了基础,为四环素在食品样品中快速检测方法的建立提供理论参考。     

沙丁胺醇免疫层析试纸条的应用研究

用胶体金和纳米金-聚苯胺-纳米金微球(GPG)分别标记制备的沙丁胺醇多克隆抗体,喷涂在玻璃纤维垫上,将包被抗原和羊抗兔二抗分别固定到硝酸纤维素膜上作为检测线(T-Line)和质控线(C-Line),干燥后组装试纸条,建立免疫层析分析方法。考查检测试纸条的灵敏度和稳定性,并应用于动物源性食品(猪肉、牛肉、羊肉和猪肝)中沙丁胺醇残留的可视化检测。实验结果可以看出,沙丁胺醇胶体金标记免疫层析分析方法的样品检出限为5μg/L,沙丁胺醇GPG标记免疫层析分析方法的样品检出限为10μg/L。     

苯甲酸免疫胶体金快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术,制备苯甲酸胶体金免疫层析快速检测试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径为17nm的胶体金,将苯甲酸金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上制成胶体金结合垫,将包被抗原和二抗羊抗兔分别结合于硝酸纤维膜作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成胶体金免疫层析试纸条并进行灵敏度测试。结果显示,胶体金试纸条检测限为100μg/L,可在5～7min内完成测试,与苯酚、甲苯、苯乙酸、苯丙氨酸等药物均无交叉反应,检测结果与酶联免疫吸附法完全一致。该方法具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高等特点,适用于现场快速检测和筛选工作,具有广泛的商业开发应用前景。      

上转换荧光猝灭试纸条检测牛奶中磺胺喹恶啉

目的:根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的原理,构建一种基于上转换荧光纳米材料的新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中的兽药磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline,SQX)残留。方法:通过热分解方法合成上转换纳米荧光材料,通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒。将合成的上转换荧光颗粒固定在试纸条C线上,并将上转换荧光颗粒与SQX包被抗原的混合物固定在T线上,将胶体金标记的SQX单克隆抗体喷涂在金标垫上。滴加样品后,随着样品液的流动,金标抗体会移动到T线处并与SQX包被抗原结合,这种结合会导致抗体上的纳米金颗粒(受体)与T线上的上转换颗粒靠近(供体),从而发生FRET,产生荧光猝灭。在980 nm激发器激发波长下通过目测检测荧光强弱变化,从而实现对SQX的检测。结果:该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1μg/L,牛奶样品的检测限为8μg/L。整个检测过程不超过15 min。结论:该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断,可以满足牛奶中SQX残留的现场快速检测的要求。     

盐酸克伦特罗快速检测胶体金试纸的研制

为建立快速检测猪尿等样品中盐酸克伦特罗（CL）的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了胶体金,将其标记抗CL单克隆抗体,制备了金标抗体;以CL-人血清白蛋白（HSA）为包被抗原、羊抗鼠IgG为质控线二抗,制成胶体金试纸。优化了胶体金颗粒粒径、标记抗体用量和pH值等各项参数,最终确定胶体金粒径为15 nm、每毫升胶体金溶液中添加20 ?g抗体、胶体金溶液pH值为7.4、金标抗体稀释液为添加0.1 %牛血清白蛋白（BSA）的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、金标抗体喷涂量为50 ?L/cm2、CL-HSA和羊抗鼠IgG的包被浓度分别0.5 mg/mL和2 mg/mL。研制的CL胶体金试纸检测限为3 ng/mL,与莱克多巴胺、沙丁胺醇等六种?-兴奋剂类药物无交叉反应。对42份猪尿样品的检测结果与市售酶联免疫（ELISA）试剂盒的符合率为100 %。试纸无需仪器辅助,操作简便,可在5 min内完成,适用于对CL残留进行现场检测。     

胶体金免疫层析法同时检测果蔬中四种农药残留

目的：研制一种胶体金免疫层析四线卡,可同时检测果蔬中毒死蜱、氟虫腈、克百威、多菌灵4种农药残留。方法：以硝酸纤维素膜为载体,农药竞争抗原为包被抗原,胶体金为标记材料,制备胶体金免疫层析四线卡,并对标记抗体浓度、检测线包被浓度、样品提取剂、提取时间等参数条件进行优化,评价四线卡的灵敏度、特异性、稳定性和准确性。结果：优化后四线卡制备工艺参数中毒死蜱、氟虫腈、克百威、多菌灵的最适标记抗体浓度为3.2、2.4、3.2、3.2μg/mL,T₁、T₂、T₃、T₄抗原包被浓度分别为0.65、0.80、0.65、0.5 mg/mL。毒死蜱检出限为0.1 mg/kg、氟虫腈为0.02 mg/kg、克百威为0.02 mg/kg、多菌灵为0.05 mg/kg,除了克百威与丁硫克百威的交叉反应率为20%,毒死蜱、氟虫腈和多菌灵与结构类似物的交叉反应率均小于5%,在室温条件下可保存至少12个月。经验证,对60份果蔬样品检测结果与仪器法检测结果一致。结论：本研究制备的四线卡操作简便、准确度高、快速、稳定,可以用于果蔬中毒死蜱...     

胶体金免疫层析法快速检测食品中金霉素残留

研究食品中金霉素残留的胶体金免疫层析法的快速检测方法。采用戊二醛交联法制备金霉素-BSA 免疫抗原,按照常规的免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗金霉素多克隆抗体。纯化后的抗体用ELISA 法检测其特异性和效价。采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒大小为15nm 的胶体金,并制备抗体- 胶体金复合物,以组装检测试纸。通过可见的颜色深浅,检测样品中金霉素的残留量。结果表明：试纸条法的金霉素检测限为0.7μg/mL,在四环素质量浓度大于1.0μg/mL 时,与金霉素存在交叉反应性,其结果与高效液相色谱法测定的结果一致。本方法检测时间仅需5min,适用于食品中金霉素残留的快速检测。     

双酚A快速检测胶体金试纸的研制

为建立一种快速检测双酚A(BPA)的方法,本论文建立以胶体金为基础的免疫层析法(GICA)。首先通过BPA人工抗原免疫Balb/c小鼠,然后利用正常的杂交瘤技术制备BPA的单克隆抗体,所制备的抗体经过辛酸-硫酸铵(CA-AS)沉淀法纯化后并鉴定为IgG2b亚型。胶体金是由柠檬酸三钠还原氯金酸而制得,通过紫外扫描光谱和透射电镜检测,结果表明胶体金在530 nm有单一吸收峰、粒径约为30 nm。用其标记BPA单克隆抗体,制备金标抗体。本研究所制备的胶体金免疫层析试纸条的检测限为100 ng/mL,检测时间为10 min,交叉反应表明,试纸条和BPA的结构类似物双酚酸、任基酚和辛基酚无交叉反应,有良好的再现性。该方法能够方便、快捷、有效的检测环境中的BPA,免疫层析试纸的研制为BPA进行现场快速的检测奠定了基础。     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

目的制备高度特异的三聚氰胺单克隆抗体,经酶联免疫吸附试验鉴定并制备胶体金试剂盒。方法以牛血清白蛋白交联的三聚氰胺为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗三聚氰胺单克隆抗体,经纯化制备腹水,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immune sorbent assay, ELISA)对抗体进行效价测定、亚类测定、交叉鉴定和蛋白质免疫印迹试验(westernblot)特异性鉴定后制备胶体金试剂盒。结果筛选出1株抗三聚氰胺单抗,制备的三聚氰胺胶体金试剂盒敏感值能达到30μg/L。结论获得了高度特异的且能稳定分泌三聚氰胺抗体的细胞株。     

呋喃唑酮代谢物抗体的制备与筛查

利用呋喃唑酮的4种代谢物合成免疫原以及包被原,用4种免疫原各免疫两只新西兰大白兔,得到8份抗血清,再纯化抗血清。采用间接ELISA方法,筛选出OD值明显高于阴性样本的血清用于以后的实验,同时对抗体的效价进行测定。实验检测结果表明,当用包被原A和包被原B包被酶标板时,7号和8号抗血清对该包被抗原有很好的亲和性,呋喃唑酮代谢物衍生物对抗体有很好的抑制。通过效价检测,7号和8号抗血清均具有高效价、高特异性的特点,其中8号抗血清的效价更高,亲和力更强。再通过进一步对两种包被原和两份抗血清进行筛查,选择B包被原和8号兔子的抗体清用于ELISA法的建立。     

基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丁香酚

目的 采用免疫层析技术对丁香酚残留的胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备开展研究。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒, 标记丁香酚单克隆抗体得到胶体金-丁香酚单克隆抗体复合物。以硝化纤维素膜为固相载体, 包被丁香酚-BSA偶联物为检测带(T带), 羊抗鼠IgG为质控带(C带), 建立了丁香酚的胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果 胶体金免疫层析试纸条具有较高的灵敏度和特异性, 检出限为2.0 mg/L。结论 本研究所开发的胶体金免疫层析试纸条可作为快速测定丁香酚的可靠、低成本的方法。     

新霉素半定量胶体金试纸条的研制

建立了一种快速、简单的检测牛乳中新霉素残留量的胶体金免疫层析法。将不同浓度的新霉素人工合成完 全抗原包被在硝酸纤维素膜上作为检测线（T1、T2线）,与待测牛乳样品中的新霉素竞争结合新霉素单克隆抗体- 胶体金标记物,通过两条T1、T2线显色情况使传统新霉素胶体金试纸条由定性检测准确到半定量检测。试纸条对 牛乳样品的半定量检测限分别为200 μg/kg和400 μg/kg,该检测限满足欧盟及国家对新霉素检测的需求,且检测牛 乳样品能够满足现场快速检测的要求,为现场快速检测牛乳中新霉素残留提供了更精确的参考依据。