冬小麦扩展蛋白TaEXPA8黑曲霉工程菌的构建及纤维素水解作用分析

农作物秸秆中大量存在的纤维素是可再生的清洁能源之一,纤维素的充分利用对于自然资源的可持续发展及环境保护有重要意义。然而,秸秆中纤维素的复杂结构使其降解工作较难开展。扩展蛋白是存在于植物及部分微生物中的一类细胞壁松弛蛋白,且来自于微生物中的扩展蛋白被证实能够提高纤维素酶的水解效率。为探究植物中扩展蛋白协同纤维素酶提高降解纤维素的能力,该研究以冬小麦扩展蛋白TaEXPA8为基础构建了黑曲霉表达载体,并以黑曲霉CICC2462为受体获得了黑曲霉工程菌pSZHGS-TaEXPA8,同时对该工程菌发酵液的纤维素水解促进作用进行了分析。结果显示,TaEXPA8基因能够在工程菌中进行正常的转录,并在发酵上清液中检测到TaEXPA8蛋白的表达,但表达量较低;工程菌的发酵液能够显著促进滤纸的崩解,水解作用产生葡萄糖的含量相比于单一纤维素酶处理提高了21.2%。该研究为植物扩展蛋白在纤维素降解中的应用提供新的思路和方法。     

高产纤维素酶菌株的选育研究

利用黑曲霉为出发菌株,经过紫外线和亚硝酸复合诱变,选育出一株高产纤维素酶的菌株,与出发菌株相比,纤维素酶高产菌株CMC酶活力提高了58．7％,滤纸酶活力提高了60．6％,而且产酶性能稳定。     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

经胆碱氨基酸水溶液预处理的水稻秸秆中残余木质素对多糖酶水解抑制作用的研究

本文通过考察牛血清蛋白(BSA)的添加量和不同纤维素酶用量下其添加与否对水稻秸秆残渣中多糖酶水解效率的影响,以及比较不同木质素含量的底物对纤维素酶催化行为的影响来探讨[胆碱][氨基酸]处理水稻秸秆残渣后其残留木质素对纤维素酶活性的抑制作用大小。结果发现,低酶量下,BSA的添加对纤维素和半纤维素的酶水解降解度有轻微的促进作用,分别最多提高5%及7%;而高纤维素酶用量时,其促进作用甚微。且经该类离子液体处理后的不同木质素含量的水稻秸秆基本上对酶蛋白皆无显著吸附和抑制作用。可见,该类离子液体可去除部分木质素以提高酶分子对多糖底物的可及性,此为多糖酶水解效率提高的关键因素,而该法所形成的残余木质素对酶蛋白的非特异吸附或抑制作用相对较弱。     

利用等离子诱变技术改造纤维素酶生产丝状真菌工业菌株

为了降低纤维素乙醇工业中的用酶成本,必须改良纤维素酶生产菌株,提高丝状真菌的纤维素酶生产效率。我们首先对草酸青霉的工业菌株进行紫外线诱变,通过纤维素双层平板初筛和摇瓶复筛,获得了纤维素降解能力有一定的提高的草酸青霉,随后再对紫外线诱变过的菌株进行等离子诱变,摇瓶培养,依据胞外蛋白浓度进行初筛,继续摇瓶复筛,得到了一株较为理想的变异菌株PQ-5,滤纸酶活(FPA)较出发株提高28.2%。这是第一次报道采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术可有效提高草酸青霉纤维素酶生产能力。     

纤维素降解菌株的筛选及其产酶条件优化

为了寻求快速有效降解沼气发酵有机质中的高分子化合物,本实验从腐殖质土壤中筛选到一株高效降解纤维素菌株,在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的液体培养基中培养,所产生的纤维素酶对玉米芯和滤纸均表现出较强降解能力。其次做了对菌株培养条件优化的实验,结果表明,菌株的最佳降解纤维素条件为反应温度30℃、发酵液接种量为1%、0.75%羧甲基纤维素钠为碳源、1.5%胰蛋白胨为氮源,优化菌株培养条件后,纤维素酶活力增加了2.8倍。     

一株产纤维素酶真菌的筛选及其对秸秆的降解效果研究

为了筛选新的降解玉米秸秆的高产纤维素酶真菌,本研究从全国不同区域采集了大量的半腐秸秆、半腐木材和富含腐殖质的土壤。通过常规分离方法共分离得到120株真菌分离物。利用纤维素刚果红培养基培养、测定滤纸酶活和羧甲基纤维素(CMC)酶活、玉米秸秆粉降解实验对分离到的120株真菌进行了三重筛选,获得了一株高产纤维素酶的真菌MC-1,并对比了MC-1、产纤维素酶木霉菌对照菌株及二者混合发酵液HJ-1对玉米秸秆室内降解效果。结果表明,MC-1在纤维素刚果红培养基上培养72h后水解圈直径达到8.52 cm;培养48h MC-1的CMC酶活为96.31 U/g,滤纸酶活为8.68 U/g,室内秸秆腐解试验表明,秸秆失重率和纤维素分解率均在15 d内迅速升高,之后升高速度放缓。MC-1在处理45 d后秸秆失重率达到了46.84%,HJ-1处理的秸秆失重率和纤维素分解率高于单一菌剂处理。     

内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

β-葡萄糖苷酶基因克隆及在丝状真菌中 高效表达的研究进展

纤维素酶是来源于真菌、细菌和原生动物并且能够降解纤维素成为葡萄糖单体的一组酶的总称, 包括内切型(β-l,4)葡聚糖水解酶、外切型(β-1,4)葡聚糖水解酶、β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖, 是纤维素酶的限速酶, 但其含量少、活力低, 成为纤维素酶解的瓶颈。因此, 通过基因重组技术构建工程菌, 开展关于β-葡萄糖苷酶基因高效表达的研究具有重要的意义。本文从β-葡萄糖苷酶及其菌株的筛选和育种、β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达、分泌及诱导等方面论述了如何使β-葡萄糖苷酶在丝状真菌中得到高效表达。     

绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究

为提高绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的能力,进行了黑曲霉接种时间和混合发酵时间的优化。研究了绿色木霉与黑曲霉4株菌单独发酵及混合发酵产纤维素酶酶活的特点,调整黑曲霉NH11-1的接种时间与绿色木霉NM01进行混合发酵来寻找产酶能力最高的时间点。结果表明,黑曲霉NH11-1推迟48 h接种的混合发酵组产酶效果最佳。最佳混合发酵条件为30 ℃、200 r/min恒温振荡培养5 d,滤纸酶活力（FPA）达到242.80 U/mL,是出发菌黑曲霉NH11-1的2.66倍;β-葡萄糖苷酶活力（β-GA）达到297.35 U/mL,是出发菌绿色木霉NM01的1.94倍;β-GA与FPA的比值为1.22,符合纤维素酶水解天然纤维素的最佳比值范围（0.12～1.50）。     

黑曲霉液体深层发酵产纤维二糖酶的研究

纤维二糖酶（cellobiase）是纤维素酶系中的重要组分之一,目前由里氏木霉（Trichoderma reesei）生产的纤维素酶制剂中纤维二糖酶的活力明显偏低,限制了纤维素的糖化效率。本文采用一个黑曲霉菌株（Aspergillus niger ZU-04）,在液态发酵条件下生产纤维二糖酶,对主要的发酵工艺参数进行了研究,结果表明,培养基中添加1.0%的麸皮对纤维二糖酶的形成有明显的促进作用;葡萄糖、玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%、0.3%;变温培养缩短了产酶周期,培养4d,酶活力达到最高,为6.23IU/mL。采用黑曲霉纤维二糖酶与里氏木霉纤维素酶协同水解酸预处理后的玉米芯,当纤维素酶用量为20IU/g底物时,纤维二糖酶活力和滤纸酶活力比例为0.43,2d酶解得率达到91.1%。     

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

航天诱变混菌固态发酵玉米芯生产单细胞蛋白的研究

黑曲霉ZM-8和啤酒酵母YB-6分别是经航天诱变而筛选出的优良纤维素降解菌和高生物积累量的单细胞蛋白生产菌.以玉米芯粉和麸皮为主要原料,采用混菌固态发酵方式,研究了啤酒酵母YB-6的接种量、接种时间、黑曲霉ZM-8和啤酒酵母YB-6共生发酵时间等因素对发酵产物中CMC酶活和单细胞蛋白含量的影响.结果表明,黑曲霉ZM-8固体曲发酵36h后接入啤酒酵母YB-6、接种量为15％ (v/w)、共生发酵为60h,有利于发酵体系中CMC酶的分泌和SCP的积累.在上述条件下,CMC酶活和SCP含量分别为32.36U/g和16.83％.     

里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化

为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果,以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质,进行里氏木霉与黑曲霉混合发酵的研究。通过单因素试验确定黑曲霉延迟接种时间、里氏木霉与黑曲霉接种比例 、发酵时间和固液比4个因素的最优水平。在此基础上,采用Box-Behnken响应面设计对混合发酵产酶条件进行优化,获得最佳产酶条件：黑曲霉延迟接种时间 36h,里氏木霉与黑曲霉接种比例 5:1、发酵时间7d、固液比2:50(m/V)、吐温-80体积分数0.4%、pH 5.0和装液量50mL/250mL。此时,滤纸酶力(FPA)可达1.224 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)可达0.315 IU/mL。采用高效液相色谱法,对最佳条件下的纤维素酶酶解秸秆的水解液进行检测。结果表明,两菌株混合发酵较单菌株发酵的纤维素酶系更加完整,且降解木质纤维素类原料产可发酵性糖的能力增强。     

双纤维素酶基因在乳酸杆菌中的融合分泌表达

为提高纤维素的降解效率,将两种不同的纤维素酶基因在乳酸杆菌中融合表达,实现双纤维素酶在乳酸杆菌中的高效表达。根据两纤维素酶的基因序列设计两对引物,并在两基因间引入一段连接肽。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）分别扩增得到两纤维素酶基因CelL15和CelL73,将其融合后连接到乳酸杆菌分泌性表达载体pMJ67中,构建重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73,电转化入乳酸杆菌Lactobacillus casei,利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆,通过PCR验证获得了分泌表达双纤维素酶的重组乳酸杆菌。电泳实验结果表明重组乳酸杆菌成功表达了1 个约为83 kD的融合蛋白。平板酶活力检测发现重组乳酸杆菌能明显降解底物中的羧甲基纤维素钠,培养液上清中纤维素酶酶活力可达1.25 U/mL。     

氯化锂诱变黑曲霉原生质体选育高产植酸酶菌株

采用氯化锂诱变黑曲霉原生质体,筛选高产植酸酶菌株。获得制备黑曲霉原生质体的最适条件:纤维素酶1.0%,蜗牛酶0.5%,菌龄24 h,酶解温度30℃,酶解时间2 h,渗透压稳定剂0.7 mol/L NaCl。采用氯化锂对制得的原生质体进行诱变,结果表明:经0.15%LiCl诱变后,原生质体存活率为23.37%,此时,获得一株植酸酶活最高的突变株,为19.24 U/mL,比出发菌株提高54.41%,该菌株具有良好的遗传稳定性。