非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A（Mut⁺）和KM71/Xyn43A（Mut^s）。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。      

甲醇蛋白联产木聚糖酶发酵培养基优化

为将实验室诱变选育出的高产甲醇蛋白毕赤酵母菌高效表达木聚糖酶,在100 L发酵罐中,对影响木聚糖酶发酵水平的培养基组分及其质量浓度等因素进行考查,初步确定培养基配方,并设计正交试验优化发酵培养基.结果表明:最优发酵培养基配方为H3PO4质量浓度25 g/L、K2HPO4质量浓度0.5 g/L、NH4 Cl质量浓度0.3...     

毕赤酵母发酵产木聚糖酶条件研究

对产木聚糖酶的毕赤酵母进行5L罐发酵研究,确定了5L罐发酵的最佳种龄是24h,最佳接种量是10%.通过对pH值、搅拌转速、温度、空气流量进行正交设计试验,得出结论:pH值和温度是影响产酶的主要影响因子,并结合实际情况,得到5L罐发酵产木聚糖酶的工艺条件:pH值为5.5,温度为30.0℃,空气流量3L/min,搅拌转速为300r/min,发酵130h,毕赤酵母发酵产木聚糖酶的酶活为2780U/mL.     

毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究

用麦麸、米糠农业废弃物作为主要原料生产木聚糖酶,对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的条件进行研究。结果表明,最适产酶条件:以质量浓度20%的麦麸作为碳源,4%酵母浸膏作为氮源,调节初始pH值5.5,培养温度30℃,摇瓶发酵装液量6%,培养时间130 h,在此条件下毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶最高活力达到2192 IU/mL。     

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。      

毕赤酵母产耐热木聚糖酶发酵工艺的研究

对毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件进行优化。单因素实验结果表明,该菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳麸皮颗粒大小为超微粉碎,实际发酵选择麸皮颗粒直径0.5mm左右;最佳氮源为酵母膏,最佳种龄为24h,最佳初始培养基pH为5.5;添加吐温-80能有效提高产酶水平。经优化后,木聚糖酶酶活达到1800IU/mL。该酶最适反应温度为70℃。      

毕赤酵母产耐热木聚糖酶发酵工艺的研究

对毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件进行优化.单因素实验结果表明,该菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳麸皮颗粒大小为超微粉碎,实际发酵选择麸皮颗粒直径0.5mm左右;最佳氮源为酵母膏,最佳种龄为24h,最佳初始培养基pH为5.5;添加吐温-80能有效提高产酶水平.经优化后,木聚糖酶酶活达到1800IU/mL.该酶最适反应温度为70℃.     

毕赤酵母木聚糖酶的活力测定条件研究

为探讨毕赤酵母木聚糖酶的催化特性以及更好地发挥其催化功能,从pH、温度、底物浓度、反应时间、DNS用量、DNS显色时间等几个方面研究了木聚糖酶活性测定的最佳条件。研究结果表明,木聚糖酶酶活测定的适宜条件为:1%的木聚糖用0.05mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液配制;测定温度70℃,且该酶的热稳定性较好.在55～60℃下放置2h能保持68%以上的酶活;酶促反应时间10min;DNS用量3mL;DNS显色时间5min。     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2(成熟肽碱基)插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35~40℃、p H5~7条件下有良好的稳定性,Ca2+对酶的激活作用最明显。     

Plackett-Burman(PB)优化植物乳杆菌增殖培养基的研究

以MRS作为基础培养基,对12种乳酸菌生长促进因子以及培养基的初始pH等13个因素,采用Plackett-Burman设计法,从13种促进因子中筛选出蔗糖、乳清粉、啤酒和培养基的初始pH值这4个重要因素对植物乳杆菌的增殖比较明显,其可信度分别为:99.9%、99.5%、99.9%和99.9%,概率P均大于99%。     

TAT-SOD在长期保藏的重组毕赤酵母中表达的条件优化

TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质。作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响。通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化。研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下（YPDM培养基,体积分数1.0%诱导剂浓度,诱导温度30.0 ℃,初始pH值7.0）,发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍。7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍。这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化。     

Plackett-Burman和Box-Benhnken Design实验设计法优化华根霉产糖化酶发酵培养基的研究

应用Plackett-Burman设计法对影响华根霉发酵的培养基组分进行筛选,所选取的11个相关因素为:葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、橄榄油、蛋白胨、黄豆粉、酪蛋白胨、麦麸、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4。确定影响产糖化酶活的关键因素为橄榄油、酪蛋白胨、麦麸,接着进行最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域。在此基础上,采用Box-BenhnkenDesign实验设计法对发酵培养基组分进行优化,得出最佳条件。此时橄榄油为0.01%、酪蛋白胨为8.14%、麦麸为4.32%、糖化酶活为18.7U,比优化前提高81%。     

木聚糖酶xynZF-318在枯草芽孢杆菌WB600中的表达及发酵条件优化

为了获得产木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌,本研究将木聚糖酶基因xynZF-318与高表达载体pWB980连接,获得重组载体pWB980/xynZF-318,并将其通过电击转化的方法导入枯草芽孢杆菌感受态细胞WB600,获得重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。采用单因素及响应面法对该工程菌进行摇瓶发酵工艺优化。结果表明:重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318最优的发酵条件为:接种量为1.2%、装液量为20 mL、种龄为11 h、培养温度为37 ℃、摇床转速为160 r/min、发酵时间为168 h。验证后实际酶活力为0.359 U/mL,与野生株WB600相比酶活提高了2.66倍。本研究成功构建了产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌,有望为木聚糖酶的工业应用尤其是食品工业应用提供新思路。     

毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定

为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体pGAP_k上得到表达载体pGAP_k-h₂-GOD,以pGAP启动GOD基因的表达。将pGAP_k-h₂-GOD上的pGAP启动子替换为pGCW14和pAOX1,并对pGCW14启动子进行改造,得到3种pGCW14的改造体,最终得到包括pGAP_k-h₂-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体。将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱。结果显示:pGCW14的启动效率是pGAP的3~5倍,改造后的启动子pGCW14+G20A/C-467T(0.767)和pGCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的pGCW14(0.574)都有明显的提高,尤其pGCW14+G20A/C-467T启动效率最高,比原始pGCW14提高了32.5%左右。与诱导型启动子pAOX1(1.187)相比,pGCW14+G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6%左右。结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景。     

牡蛎抗菌肽Molluscidin的密码子优化、重组毕赤酵母表达及抑菌活性

目的:利用重组毕赤酵母高效表达抑菌活性较好的牡蛎抗菌肽Molluscidin.方法:按照毕赤酵母密码子偏好性优化合成牡蛎抗菌肽Molluscidin,利用生物信息学方法分析其基本理化性质,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后与表达载体pPICZαA连接,构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,电转至毕赤酵母X-33,利用博...     

Plackett-Burman法和中心组合法优化罗非鱼下脚料酶解工艺

采用Plackett-Burman(PB)试验、最陡爬坡试验和中心组合设计法对木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解罗非鱼鱼头鱼排酶解工艺进行优化。首先,采用Plackett-Burman设计从影响酶解效果的6因素中筛选出水解时间、固液比2个显著影响因素,在此基础上,通过最陡爬坡试验逼近最大水解度区域,然后通过中心组合设计试验对显著因素进行优化。得出最佳工艺条件为水解时间4h、固液比1:6.25(g/mL),温度45℃、自然pH值、酶用量0.3%、复合酶(风味蛋白酶:木瓜蛋白酶比例)1:3,酶解条件优化后实验测得罗非鱼鱼头鱼排的水解度为22.38%,与预测值21.50%接近。说明本优化工艺具有可行性。     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。