凡纳滨对虾内源蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用

为确定引起凡纳滨对虾自溶的主要酶类及分布部位,本文测定了凡纳滨对虾各内源蛋白酶的活性,分析主要内源蛋白酶贮藏期间的变化,并比较主要内源蛋白酶对虾肌原纤维蛋白的降解作用。结果显示,虾头蛋白酶活达90.17U/mg,是虾肉的300倍。虾头中的胰蛋白酶活性最高,达13.59U/mg。全虾贮藏4d后虾肉总酶活和胰蛋白酶活增加,于第8d虾肉第一腹节总酶活增至1.66U/mg,胰蛋白酰胺酶和酯酶活分别达到0.97U/mg和1.84U/mg。SDSPAGE结果显示,随贮藏温度和时间的增大,内源酶对肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白(Actin)降解程度越大,其中虾头中胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用最强。因此凡纳滨对虾胰蛋白酶很可能是肌肉软化的主要作用酶。     

凡纳滨对虾内源蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用

为确定引起凡纳滨对虾自溶的主要酶类及分布部位,本文测定了凡纳滨对虾各内源蛋白酶的活性,分析主要内源蛋白酶贮藏期间的变化,并比较主要内源蛋白酶对虾肌原纤维蛋白的降解作用。结果显示,虾头蛋白酶活达90.17U/mg,是虾肉的300倍。虾头中的胰蛋白酶活性最高,达13.59U/mg。全虾贮藏4d后虾肉总酶活和胰蛋白酶活增加,于第8d虾肉第一腹节总酶活增至1.66U/mg,胰蛋白酰胺酶和酯酶活分别达到0.97U/mg和1.84U/mg。SDSPAGE结果显示,随贮藏温度和时间的增大,内源酶对肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白(Actin)降解程度越大,其中虾头中胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用最强。因此凡纳滨对虾胰蛋白酶很可能是肌肉软化的主要作用酶。      

凡纳滨对虾组织蛋白酶L性质分析及其对肌肉蛋白的降解

本研究从凡纳滨对虾肝胰腺中纯化获得一种组织蛋白酶L,其分子质量约为31 k D,肽质量指纹图谱分析得到8个片段共112个氨基酸残基,与报道的凡纳滨对虾组织蛋白酶L序列完全一致。该酶的最适温度和最适pH值分别为35℃和5.5,且在0~40℃以及pH 5.5~6.5之间酶活力稳定。该酶仅对底物Z-Phe-Arg-MCA特异分解。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和Leupeptin对其有明显的抑制作用,而金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸对其有少量的激活作用。扫描电子显微镜观察结果显示,随着低温贮藏时间的延长,对虾肌肉纤维的断裂程度不断增加。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,组织蛋白酶L可使肌肉蛋白发生分解,推测其可能参与对虾低温贮藏过程中肌肉的降解。     

凡纳滨对虾蛋白体外降脂作用分析

为了考察凡纳滨对虾蛋白的体外降脂作用,以胆酸盐吸附能力、胰脂肪酶抑制率、降胆固醇作用、胆固醇酯酶反应作用等为研究指标,对凡纳滨对虾蛋白不同pH沉淀组分降脂特征进行研究。结果表明,凡纳滨对虾蛋白含量为18.40%,不同分离组分蛋白对胆酸盐有很好的吸附能力,其中对牛磺胆酸钠吸附能力最强的是pH6组分(91.3%),对甘氨胆酸钠吸附能力最强的是pH6组分(75.1%),对脱氧胆酸钠吸附能力最强的是pH4组分(63%);pH7组分对胰脂肪酶的抑制率高达76.8%;降胆固醇作用最高是pH9组分(83.9%),最低为pH7组分(67.3%);而不同组分对胆固醇酯酶的抑制率存在较大差异,最高为pH10组分(83%),最低为pH4组分(23%)。综上,凡纳滨对虾蛋白有一定的体外降脂功效。     

凡纳滨对虾肌肉蛋白质组成及分子量分布研究

为了合理利用凡纳滨对虾蛋白质,对凡纳滨对虾肌肉进行蛋白分离,利用氨基酸自动分析仪检测蛋白的氨基酸组成及用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定分子量分布。实验结果表明:总蛋白为(19.72±0.08)g/100g湿重,其中盐溶蛋白64.30%、水溶性蛋白25.00%、基质蛋白5.78%、非蛋白氮4.92%;凡纳滨对虾各蛋白氨基酸比例存在一定差异,但它们的第一限制氨基酸类似;SDS-PAGE电泳显示,凡纳滨对虾基质蛋白分子量分布范围较宽,集中在200~19ku,盐溶蛋白分子量集中在200~45ku,水溶性蛋白分子量集中在80~27ku。     

凡纳滨对虾肌肉蛋白质组成及分子量分布研究

为了合理利用凡纳滨对虾蛋白质,对凡纳滨对虾肌肉进行蛋白分离,利用氨基酸自动分析仪检测蛋白的氨基酸组成及用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定分子量分布。实验结果表明:总蛋白为（19.72±0.08）g/100g湿重,其中盐溶蛋白64.30%、水溶性蛋白25.00%、基质蛋白5.78%、非蛋白氮4.92%;凡纳滨对虾各蛋白氨基酸比例存在一定差异,但它们的第一限制氨基酸类似;SDS-PAGE电泳显示,凡纳滨对虾基质蛋白分子量分布范围较宽,集中在200¹9ku,盐溶蛋白分子量集中在200⁴5ku,水溶性蛋白分子量集中在80²7ku。      

凡纳滨对虾肌肉蛋白质的热变性及其对品质的影响

以凡纳滨对虾为对象,利用拉曼光谱技术研究加热过程中肌肉蛋白二级结构变化对品质特征的影响。研究结果表明:在加热过程中凡纳滨对虾二级结构发生了较大变化,导致质构特性及失水率发生相应的变化。在加热初始阶段30s时,凡纳滨对虾虾肉失水率为0.72%。随着加热时间的延长,失水率快速增加,10 min时达14.8%;同时虾肉质构指标也发生明显变化,即:硬度由初始的991.7848 N增至2 167.7830 N,最后降至1 768.9260 N;弹性由1.1805增至1.3131,再减至1.3088;黏性由7.6197 Pa·s减至1.6068 Pa·s,又增至3.2155 Pa·s;而内聚性、胶黏性、回复性、耐咀性均呈先生高后略微降低的趋势。这可能与虾肉蛋白加热过程中二级结构发生构象变化密切相关,其中α螺旋由新鲜的23.14%降至18.64%,β-折叠含量由23.91%升至29.51%,无规卷曲结构由31.80%升至33.91%。     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达及性质研究

通过PCR扩增得到凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)基因,将其插入大肠杆菌表达载体p ET-28a,实现丝氨酸蛋白酶抑制剂在BL21(DE3)菌中以包涵体的形式大量表达。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量约为15 ku,与预期大小一致。将包涵体溶解后,利用Ni2+亲和柱层析对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组SPI。经复性后的SPI对胰蛋白酶具有较高的抑制活性。该抑制剂在90℃内加热1 h,可保留90%以上的抑制活性,且在p H 1~8范围内较稳定。该抑制剂能特异性抑制凡纳滨对虾内源性胰蛋白酶的活性。抑制动力学试验结果表明,该抑制剂是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为1.69×10-9mol/L。结论:重组凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较高的抑制活性且较稳定,经优化表达条件后有望应用于新型对虾保鲜剂。     

凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳分离技术的建立及优化

建立凡纳滨对虾肌肉组织双向电泳分离技术并对其进行优化。通过液氮研磨和液氮研磨+超声破碎的方式提取对虾肌肉组织蛋白质。采用7 cm的IPG胶条进行双向电泳,凝胶染色后进行图谱分析,并对裂解液配方、胶条p H值、蛋白质上样量、凝胶染色进行优化。结果显示,以液氮研磨+超声破碎,裂解液Ⅱ提取对虾肌肉蛋白质;采用p H 4~7 IPG胶条,180μg蛋白质上样量,并用考马斯亮蓝G-250胶体考染(蓝银)染色,成功得到背景清晰,分辨率较高的凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳图谱,这为凡纳滨对虾肌肉蛋白质组学分析及肌肉品质变化的分子标记识别提供基础。     

超高压处理对凡纳滨对虾品质的影响

研究不同超高压处理条件下对虾质构、颜色差异、水分活度、水分含量、可析水分量、粗蛋白含量、挥发性盐基氮、微观结构的变化。通过对虾硬度、弹性、色彩色差、水分含量、水分活度和挥发性盐基氮的测定,研究超高压和热加工处理对对虾的新鲜度的影响,从而进一步研究超高压处理对对虾的保鲜作用;同时通过微结构的观察研究超高压对对虾结构的影响。试验发现,超高压处理后对虾的颜色特性发生变化,随处理压力和保压时间的增大,对虾的颜色变淡,出现轻微的类似蒸煮的成熟风味;其质构也发生了明显的变化,硬度随之增大,弹性先在低压区域出现下降的趋势,继而随着压力的增大和保压时间的延长,弹性也增大。在压力为500 MPa,保压时间为25 min的处理条件下,对虾虾肉的显微组织结构变化明显,虾肉肌纤维的网状结构的间隙变小。试验结果表明,超高压处理使对虾的品质发生了显著变化。     

发酵豆粕替代鱼粉对凡纳滨对虾的作用效果研究

本试验旨在研究发酵豆粕替代鱼粉对凡纳滨对虾生长、营养物质利用、肝胰腺消化酶活性和血淋巴非特异性免疫指标的影响。以豆粕(负对照组)、发酵豆粕T468、P839、B356和Y918等蛋白质替代正对照饲料中6%鱼粉(正对照饲料含21%鱼粉),另以发酵豆粕B356等蛋白质替代正对照饲料中9%鱼粉(B356-2),配制成7纽等氮饲料,饲喂平均质量4.0 g的凡纳滨对虾42 d。结果表明:发酵可部分降解豆粕中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白质及大分子蛋白质,提高粗蛋白质和小肽含量;与负对照组相比,发酵豆粕T468、P839、B356、Y918替代6%鱼粉后,提高凡纳滨对虾增重率16.7%、12.0%、9.9%、11.9%,降低饲料系数18.1%、13.7%、12.6%、14.8%(P0.05),到达和正对照组基本一致的生长性能,同时显著提高了蛋白质效率、蛋白质沉积率、干物质消化率和蛋白质消化率(P0.05);各发酵豆粕组均较负对照组显著提高了肝胰腺淀粉酶活性和血淋巴SOD活性(P0.05),P839组的蛋白酶活性和血淋巴PO活性显著高于负对照组(P0.05)。发酵可改善豆粕的可利用性,在不影响凡纳滨对虾生长和饲料利用的前提下,发酵豆粕可替代饲料中6%鱼粉。     

T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉蛋白质含量与组成的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,采用肌肉蛋白质分离法提取蓄积染毒的染毒组和对照组中对虾肌肉的各类蛋白质成分。以考马斯亮蓝法测定其含量,应用SDS-PAGE电泳分析各类蛋白的组成。结果表明:T-2毒素对肌肉蛋白质组成成分影响显著(P0.05);对于总蛋白,20 d蓄积染毒组和生物半衰期剂量组的对虾总蛋白中20.1ku条带的颜色变化随T-2毒素浓度的增加逐渐加深,且20 d蓄积染毒的高剂量组在29 ku处出现新增条带;对于水溶性蛋白,20 d蓄积染毒组的42 ku条带的颜色随T-2毒素浓度的增加逐渐加深,而生物半衰期剂量组的对虾则没有明显表现;对于肌原纤维蛋白,20 d蓄积染毒组的42 ku出现新增的条带,而生物半衰期剂量组未发现新增条带;对于碱溶性蛋白,两种染毒组均未发现明显变化。     

海水养殖凡纳滨对虾肠道产蛋白酶菌株的筛选、鉴定

为开发海洋来源的微生物蛋白酶,本文以海水养殖凡纳滨对虾肠道为原料,利用蛋白酶水解圈法初筛得到27株产蛋白酶菌株,测定菌株的透明圈直径与菌落直径比值(即D/d)初步估计其产酶能力,通过发酵液酶活测定复筛得到一株高产蛋白酶菌株,编号为xc10,通过形态学观察、生理生化鉴定、16S r DNA基因序列分析及系统发育树分析进行菌种鉴定,并对其发酵液粗蛋白酶的酶学性质进行了初步探讨。结果表明:菌株xc10为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),蛋白酶的最适温度为50℃;最适p H为7.5;Fe3+、Cu2+、EDTA对该酶有抑制作用,但Zn2+对该酶有激活作用。因此,从海水养殖的凡纳滨对虾肠道中分离得到的产蛋白酶的菌株xc10为一株中性、中温蛋白酶菌,为开发利用海洋微生物蛋白酶在水产品加工的应用提供了理论基础。     

冷冻方式对凡纳滨对虾品质特性的影响

以质构、盐溶性蛋白、ATPase活性、巯基含量、失水率及pH为指标,研究液氮速冻、-75℃超低温速冻和-18℃冷库冷冻3种冷冻方式对凡纳滨对虾品质特性的影响。结果表明:液氮速冻处理组失水率最低,盐溶性蛋白含量、巯基含量、ATPase活性及pH值均显著低于新鲜对虾,却明显高于-75℃超低温速冻和-18℃冷库冷冻;凡纳滨对虾经3种冷冻方式处理后其质构变化不大,其中液氮速冻处理组与新鲜对虾之间的差异最小。     

加热方式对凡纳滨对虾滋味成分的影响

以凡纳滨对虾为原料,通过仪器分析法对微波加热与水煮处理的对虾的游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸、甜菜碱和无机离子这些主要滋味成分进行了分析。结果表明:凡纳滨对虾经微波加热与水煮处理后,游离氨基酸总量均有减少,分别下降了15.81%,20.19%;呈味核苷酸总量也均有减少,分别降低了25.07%,25.89%,其中含量最高的腺苷酸(AMP)有所提高,分别增加了4.01%,5.95%;乳酸含量大幅降低,分别减少了53.64%,77.24%;甜菜碱的含量也有明显的差异,分别减少了7.26%,8.83%;呈味无机离子含量差异明显,且微波虾的要高于水煮虾。通过研究分析发现,微波虾中除AMP含量略低于水煮虾外,游离氨基酸、有机酸、甜菜碱和无机离子的含量均高于水煮虾,表明微波虾的滋味优于水煮虾。     

热处理对凡纳滨对虾虾仁加工品质的影响

为了研究热处理对凡纳滨对虾虾仁加工品质的影响,测定虾仁的菌落总数、颜色、硬度和pH值的变化,并采用电泳技术对虾仁蛋白进行分析。水浴加热温度设置为40～90℃,处理时间均为10min。与对照组相比,热处理显著(P<0.05)减少了虾仁的菌落总数。当温度高于40℃时,虾仁色泽更亮,变得不透明。随温度升高,虾仁的白度(WI)与总色差(ΔE)整体呈增大趋势,而其pH值和硬度呈倒"S"型变化。电泳分析表明,虾仁蛋白质分子间的非共价键交联程度随温度升高而加剧,在60℃条件下低分子质量的蛋白条带增多,而在较高温度下部分变性蛋白通过分子间二硫键发生聚合。以上表明,热处理条件下虾仁蛋白并非通过单一变化过程影响虾仁品质特性。     

凡纳滨对虾下脚料综合加工工艺研究

研究了以凡纳滨对虾下脚料为原料,同时制备调味基料和多功能饲料添加剂.应用酶解技术,对凡纳滨对虾下脚料采用双酶复合酶解(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)方法生产调味基料,在确定了料液比为1∶1,酶解初始pH为6.80,盐添加量为3.0％的情况下,进一步利用Box-Behnken响应面法获得最优醇解工艺为:酶解温度62.42℃,酶解时间3.28h,加酶量1046 U/g,测得最终水解度DH为(28.15±0.10)％,苦味值BV为33.05±0.21.通过对比2种干燥工艺,确定了从凡蚋滨对虾下脚料中生产多功能饲料添加剂的最佳干燥工艺条件为:采用微波干燥,参数为3 W/g,启闭比为0.5.     

凡纳滨对虾肉糜凝胶动力学模型研究

为了研究虾肉糜的凝胶特性,改善虾肉肠的品质,研究了凡纳滨对虾肉糜在低温凝胶化后,高温加热过程中虾肉糜的凝胶强度、失水率、白度及蛋白质组成变化,并在此基础上探索蛋白质组成和虾肉糜凝胶强度度之间的关系,绘制了升温曲线,建立了虾肉糜凝胶一级反应动力学模型。结果表明,升温的过程中,凝胶的强度和白度有不同程度的提高,失水率呈先降低后升高的趋势,盐溶性蛋白质和水溶性蛋白质含量降低,而不溶性蛋白质的含量升高;虾肉糜的实际升温曲线和用公式预测的升温曲线有很高的拟合度;凝胶率在80%之前,符合一级动力学方程,但凝胶形成约80%后,形成速率明显减小,不再符合一级动力学方程。     

低压静电场对凡纳滨对虾多酚氧化酶性质影响

以凡纳滨对虾为研究对象,考察在微冻保鲜条件下低压静电场（low-voltage electrostatic field,LVEF）对凡纳滨对虾多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）的影响。以在冰箱中贮藏的对虾作为对照组（Con组）。试验对比分析PPO性质,如酶活性、总巯基、Ca2+-三磷酸腺苷酶（Ca2+-adenosine triphosphatase,Ca2+-ATPase）活性等指标,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis,SDS-PAGE）和圆二色谱探究PPO构象变化。结果显示：除12 d外,LVEF组PPO酶活性低于Con组,贮藏24 d时LVEF组PPO酶活性为117.5 A/（min·mL）,Con组为126 A/（min·mL）,说明低压静电场下酶活性受到了抑制。Con组与LVEF组样品的总巯基、总蛋白含量和Ca2+-ATPase活性总体呈下降的趋势,但LVEF组这3个指标活性下降明显,说明低压静电场下PPO蛋白发生了显著的变性作用。SDS-PAGE电泳显示Con组与LVEF组PPO的分子量无明显变化;圆二色谱和表面疏水性的结果显示LVEF组PPO的二级结构有明显变化,说明LVEF通过影响PPO结构影响酶的活性。     

凡纳滨对虾肉糜凝胶动力学模型研究

为了研究虾肉糜的凝胶特性,改善虾肉肠的品质,研究了凡纳滨对虾肉糜在低温凝胶化后,高温加热过程中虾肉糜的凝胶强度、失水率、白度及蛋白质组成变化,并在此基础上探索蛋白质组成和虾肉糜凝胶强度度之间的关系,绘制了升温曲线,建立了虾肉糜凝胶一级反应动力学模型。结果表明,升温的过程中,凝胶的强度和白度有不同程度的提高,失水率呈先降低后升高的趋势,盐溶性蛋白质和水溶性蛋白质含量降低,而不溶性蛋白质的含量升高;虾肉糜的实际升温曲线和用公式预测的升温曲线有很高的拟合度;凝胶率在80%之前,符合一级动力学方程,但凝胶形成约80%后,形成速率明显减小,不再符合一级动力学方程。