fps转基因烤烟类胡萝卜素及其降解产物的研究

为探索法呢基焦磷酸合酶(fps)对烤烟中类胡萝卜素及其降解产物的影响,利用常规和GS/MS方法,对转fps基因烟草株系(K-4、K-6、K-17、K-35)烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香气物质含量进行了分析,结果发现,烤后烟叶类胡萝卜素含量有较大差异,与未转基因对照相比普遍有所提高,其中K-35含量最高;8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量有不同程度的提高,其中K-35香气降解产物含量整体较高,表明外源fps基因在烟草中的表达对类胡萝卜素合成具有促进作用,从而有利于烟叶品质的提高。     

转fps基因烟草纯合系的获得及其特性分析

携带有外源法呢基焦磷酸合酶（fps）基因和卡那霉素抗性基因（Npt—Ⅱ）的烟草种子在含卡那霉素（300mg／L）的培养基上能够正常地萌发和生长，对照种子虽能萌发，但幼苗形态与对照有着明显的差异。转fps基因植株所具有的卡那霉素抗性和与其抗病性之间密切相关，由此建立了一种鉴定转基因烟草后代纯合度的简易方法，得到4个fps转基因烟草纯合系（K-4、K-6、K-17、K-35），并对其农艺性状、田间抗性、化学成份和品质进行了评估，其中K-4转基因品系的综合性状较原有品种有所提高。     

烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。     

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

  目的   “Gene-deletor”系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。  方法   以含有“Gene-deletor”系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。  结果   （1）相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。（2）Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,（3）花粉GUS组织染色结果表明,“明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。  结论   在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动“动启动子驱动达基因,平均清系统（LoxP/FRT）的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。      

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

转OjDREB基因提高烟草耐盐能力的研究

利用农杆菌介导法将沿阶草OjDREB基因转入烟草植株中.通过RT-PCR检测,获得转OjDREB基因的烟草植株.以400 mmol/L NaC1处理转基因烟草植株和野生型对照10 d后,结果显示:转基因烟草体内叶绿素含量和SOD酶活性是野生型对照的16.98倍和1.91倍;体内的MDA含量和电解质渗透率分别是野生型对照的59.23％和55.07％,说明过量表达OjDREB基因可以提高烟草的耐盐能力.     

云南清香型烤烟质体色素合成规律研究

以K326为试验材料研究了云南烤烟叶片发育过程中叶绿素和类胡萝卜素含量变化规律,及其生物合成途径中关键酶基因表达变化规律。结果表明:在叶片发育早期,质体色素含量逐渐升高,其合成关键酶基因表达活跃,合成过程占据优势;从30 d叶龄开始,质体色素含量进入了缓慢下降时期,相关基因表达减弱,合成受阻;从70 d叶龄开始,质体色素含量急剧下降,但合成关键酶基因的表达并未出现陡降现象。表明30 d叶龄和70 d叶龄是质体色素代谢调控的关键时期。     

过表达TaGS1/TaGS2对烟草抗盐能力的影响及其机制

为了阐明提高谷氨酰胺合成酶（GS）活性是否可以提高烟草的耐盐能力，本试验以烟草栽培品种K326为对照，研究TaGS1/TaGS2转基因烟草抗盐能力及其机制。结果表明，盐胁迫条件下，过表达TaGS1/TaGS2烟草与对照相比，根系较发达，烟株生物量较高，TaGS2转基因烟草尤为显著；转基因烟草的叶绿素含量、气孔导度、净光合速率、GS活性、可溶蛋白含量等碳氮代谢功能均显著优于野生型K326；且转基因株系脯氨酸含量及含水量较高，MDA含量较低，叶片渗透调节能力和质膜保护能力比K326强。研究表明TaGS1/TaGS2的过表达提高了烟草的耐盐能力，其高GS活性是维持碳氮代谢抵抗盐胁迫的生理基础。      

烟草中异源表达番茄HQT基因对多酚物质合成的影响

羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT）是催化茄科植物咖啡酰奎尼酸生物合成最后一步的关键酶。为培育富含多酚物质的烟草,提高烟草品质,通过克隆番茄HQT基因,构建P35S：：SlHQT超量表达载体,在野生型三生烟草（SS）中异源表达,利用高效液相色谱技术（HPLC）及液质联用（LC-MS/MS）技术对转基因烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇含量进行检测,探究SlHQT基因对三生烟草一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇物质合成的影响。结果显示,转SlHQT烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸总含量最高可提高14.98倍,芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高11.47和9.32倍,且生长表型与野生型烟草没有明显差异;转SlHQT基因烟草叶片中有4种（1-CQA,3-CQA,4-CQA,5-CQA）一咖啡酰奎尼酸,野生型烟草叶片中只检测到3种（3-CQA,4-CQA,5-CQA）。SlHQT基因在烟草中的异源表达促进了1-CQA的生物合成且提高了一咖啡酰奎尼酸总含量,同时增加了黄酮醇的生物合成。     

Metabolic engineering strategies for the production of beneficial carotenoids in plants

Adequate consumption of carotenoids including lycopene, β-carotene, lutein, zeaxanthin, and astaxanthin have many benefits for human health. In plants, carotenoids are derived from isoprenoid precursors from the 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway located in plastids. The MEP pathway is also required for the biosynthesis of chlorophyll, terpenoids, plant hormones, and other metabolites. Despite its complexity and difficulty, various strategies have been successfully used to improve the carotenoid biosynthesis in plants through metabolic engineering. Here, these metabolic engineering strategies are reviewed. In addition, the development of gene stacking technologies for carotenoid biosynthesis is evaluated. These technologies will expedite our efforts to bring the health benefits of carotenoids and other nutritional compounds to our diet.     

外源dsRNA介导的RNAi对烟草CMV侵染的抑制作用

为研究外源dsRNA介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）对烟草黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白（Movement protein, MP）基因为靶标,通过克隆CMV MP基因,结合序列分析评估设计dsRNA,以体外合成的方式制备了MP基因中一段490 bp的dsRNA。通过与CMV共接种,结合MP基因表达水平和病毒发病症状,综合评价MP dsRNA对CMV的抑制效果。结果表明,外源喷施的MP dsRNA显著降低了染病烟株中CMV基因的表达水平,有效抑制了病毒的侵染和危害,具有烟草CMV生物防治的应用潜力。     

Improvement in pulping and bleaching properties of xylem from transgenic tobacco plants

In an attempt to improve the pulping properties of xylem pieces and the bleaching properties of the resultant pulp, we compared two lines of transgenic tobacco in which the biosynthesis of lignin had been altered by suppression of the activity of 4‐coumarate: CoA ligase (4CL). The results of Kraft pulping on a laboratory scale indicated that the xylem of transgenic tobacco exhibited a higher delignification efficiency than that of corresponding controls subjected to the same conditions. This facilitated delignification was accompanied by a high pulp yield, but there was no excessive degradation of cellulose in the pulp fibres. The unbleached pulps from the 4CL‐suppressed tobacco plants were easily bleached with a lower consumption of chemicals than was required for the controls. Furthermore, the strength and optical properties of handsheets prepared from the 4CL‐suppressed tobacco plants were similar to those of handsheets prepared from the controls. Our observations suggest that modification of lignin by genetic engineering of the suppression of 4CL activity should result in both an increased pulping yield and a saving of bleaching reagent. © 2002 Society of Chemical Industry     

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

类胡萝卜素代谢工程研究进展

类胡萝卜素是一类微生物、藻和植物体产生的重要天然色素。在食品、饲料、营养保健工业都有广泛的应用。文中从类胡萝卜素生物合成途径、相关基因分离,以及代谢调控其在微生物和高等植物中的生物合成等方面介绍类胡萝素代谢工程研究进展。     

1 株类胡萝卜素产生菌的鉴定及其发酵培养基的优化

利用形态学、生理生化和rDNA-ITS序列分析相结合的方法鉴定1 株产类胡萝卜素的菌株K-1,采用比色法测定其生长和所产类胡萝卜素的稳定性,借助单因素试验和正交试验优化K-1菌株的发酵条件。结果表明,菌株K-1为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）,最适生长温度30?℃,生长pH值范围2～7;含有红酵母烯,所产色素的基本稳定性良好,但高温（＞60?℃）、强光和添加氧化剂H2O2可使其稳定性下降。菌株K-1产类胡萝卜素的最适发酵条件为20?g/L葡萄糖、20?g/L?(NH4)2SO4、2?g/L无水CaCl2、5?g/L柠檬酸三钠（培养温度30?℃、接种量10%、摇床转速150?r/min、装瓶量50?mL/250?mL、初始pH?5.5、培养5?d）;优化条件下类胡萝卜素产量达（180.14±2.45）μg/g（干菌体）。研究表明,菌株K-1具有高产类胡萝卜素的潜能,色素稳定性良好,可为微生物类胡萝卜素的发酵生产提供菌种资源。