黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究

松萎蔫病是由松材线虫引起的一种危害性极大的森林病害,为研究黑松对松材线虫的抗性机制,本文利用RT-PCR技术对黑松体内经转录组分析获得的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列进行扩增,获得了银松素合成酶cDNA,然后将此银松素合成酶基因(PSL)克隆到表达载体pET-15b上,构建了重组表达质粒pET-15b-PSL,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后构建工程菌,通过IPTG诱导,工程菌高效表达重组蛋白,经Ni 2+螯合柱亲和层析得到了纯化重组银松素合成酶。该研究为了解黑松银松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松树的培育奠定了基础。     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

绿色荧光蛋白标记在MEOR中的应用研究

为了充分认识目的优势菌种经油藏运移后在产出水中分布的规律与数量,准确分析和客观评价MEOR现场试验效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记目的菌,通过绿色荧光蛋白跟踪监测目的菌的动态信息。构建含有GFP基因的质粒pET-30a(+)-EGFP,并将其成功导入JD中。对构建的JD(gfp)工程菌进行培养发现,该工程菌在含有Kan质量浓度50μg/mL的培养条件下,重组质粒在JD(gfp)工程菌体内传代稳定,绿色荧光的表达稳定。但是在没有选择压力的培养条件下,重组质粒在JD工程菌胞体内有丢失现象。与野生菌混合培养,JD(gfp)工程菌具有很好的配伍性和竞争性,并且不发生重组质粒的水平转移,因此在环境中释放是安全的。     

重组精氨酸脱亚胺酶的制备工艺

研究了重组精氨酸脱亚胺酶(r ADIES)的30 L规模发酵、制备工艺及其生物学活性。将构建好的工程菌先进行摇瓶活化获得种子液,转入30 L发酵罐进行培养,用IPTG进行诱导表达;表达产物进行高压匀浆破菌、包涵体洗涤、溶解稀释复性后经DEAE阴离子交换层析柱和Butyl疏水层析柱纯化;通过SDS-PAGE和RP-HPLC等方法检测表达和纯度;用体外测活法检测活性。将工程菌进行放大培养并诱导表达,获得了相对分子质量在46 k Da的r ADIES。重组蛋白表达量占总蛋白的25%以上,经制备工艺获得的r ADIES纯度高于95%,酶活性为42IU。实验结果表明:该工艺具有可行性,可以获得较高活性的重组精氨酸脱亚胺酶。     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

一株微生物采油菌的16S rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

筛选到一株高效生产多糖的YX菌,油田先导试验证明该菌可以用于微生物调剖提高原油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR）.经16SrDNA分析鉴定,YX菌属于肠内杆菌属（Enterobacter.）,为跟踪监测其动态信息,构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组质粒pET-30a（＋）-EGFP,利用CaCl2法将其转化至YX菌,利用荧光显微镜可以观察到重组YX（GFP）工程菌的绿色荧光.结果表明YX菌可以被绿色荧光蛋白基因标记,用于微生物采油研究.     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。     

康宁木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

为拓宽酵母菌的应用领域,构建具有分泌纤维素酶能力的酵母工程菌,利用质粒pPICZαA构建了康宁木霉纤维素酶cbh2基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤氏酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果证明该基因可成功表达.对重组蛋白进行了产酶活性测定,结果证明该重组蛋白具有纤维二糖水解活性,从而获得了一株可产生纤维素酶的酵母工程菌.     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

人γ-干扰素基因工程菌培养条件的研究

对表达重组人γ-干扰素的基因工程菌的培养条件进行了较详细的研究．确定了最佳的培养及诱导时间，并利用正交试验设计，对影响工程菌生长和重组人γ-干扰素表达的条件如培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物的量及摇床转速、装液量、接种量、pH等进行了优化．结果表明，在优化条件下，表达的γ-干扰素包涵体占菌体总蛋白的60％以上，每升发酵液可获得包涵体约为1．6g．     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

鼠CCL5蛋白的原核表达与纯化

趋化因子(CCL5)是由正常T细胞分泌的典型的具有趋化活性的细胞因子,分子量8kD,属于CC型趋化因子的β家族成员之一,并调控T淋巴细胞的活性和分泌能力.本研究旨在克隆小鼠趋化因子CCL5基因并在原核表达系统中实现表达,获得与His标签融合的重组趋化因子mCCL5蛋白,并测定其在体外的趋化活性.将趋化因子CCL5基因扩增并插入pET-28a原核表达载体,转化至Rosetta感受态细胞中.重组mCCL5蛋白以IPTG诱导表达,再以Ni-NTA纯化系统进行纯化.Transwell实验检测重组CCL5蛋白的趋化活性.结果显示pET-28a-mCCL5原核表达载体成功构建,mCCL5蛋白在细菌中大量表达并主要以包涵体的形式存在.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,Transwell实验证实趋化因子能够显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的迁移.带有His标签重组鼠趋化因子CCL5的成功表达,为下一步CCL5抑制剂的筛选奠定基础.     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。