NtPHGPx基因过表达和敲除对烟草苗期耐盐性的影响

为研究NtPHGPx基因对烟草耐盐性的影响,通过转基因技术获得NtPHGPx基因过表达和CRISPR/Cas9敲除材料,利用150 mmol/L NaCl对转基因材料处理14 d,研究盐处理下转基因材料根长、GPx酶活性、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量的变化。结果表明,NtPHGPx基因表达在盐胁迫3 h后即受到诱导;盐处理显著抑制了野生型烟草根部的生长,提高了丙二醛和过氧化氢的积累;盐胁迫下过表达株系的根长比野生型更长,MDA和H₂O₂含量较低,而基因敲除材料根的生长则进一步受到抑制,GPx酶活性明显降低,地上部MDA和H₂O₂的积累显著高于野生型。综上所述,过表达NtPHGPx基因提高了烟草的耐盐性,而敲除NtPHGPx基因则减弱了烟草的耐盐性,推测NtPHGPx基因可能通过影响烟草体内活性氧物质的清除活性参与植株对盐害的胁迫响应。     

烟草DELLA基因家族的克隆与表达模式分析

为明确烟草受逆境胁迫时DELLA基因家族的转录调节功能,通过烟草EST序列比对分析克隆了3个DELLA基因家族基因（NtDELLA1,NtDELLA2,NtDELLA3）,并对3个基因的结构和表达模式进行了分析。生物信息学分析结果表明,烟草DELLA基因全长1 700 bp左右,其编码蛋白包含DELLA蛋白的特征结构域DELLA基序和VHYNP基序,与拟南芥DELLA蛋白家族的GAI蛋白高度同源,推测烟草DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白具有类似的功能;荧光定量PCR分析结果表明,这3个基因在烟草不同组织和关键生长发育时期表达模式类似,尤以茎中表达量最高;胁迫应答分析结果表明,烟草DELLA基因的转录对干旱、低温、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染和外源激素均表现出不同程度的响应,其中干旱、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）可抑制烟草DELLA基因的表达,而低温胁迫可诱导NtDELLA1上调表达,TMV侵染可诱导NtDELLA1和NtDELLA2的大量表达。      

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

干旱胁迫下烟草脯氨酸杂种优势及相关基因差异表达分析

为探讨干旱胁迫下烟草脯氨酸杂种优势的分子遗传基础,以抗旱性差异较大的7个烟草品种及其组配的10个杂交组合为材料,采用盆栽试验设置干旱胁迫处理,进行了烟草脯氨酸杂种优势及其相关基因差异表达分析。结果表明,干旱胁迫下烟草脯氨酸含量在胁迫早期持续增加,第14天后开始下降;杂交组合间脯氨酸含量性状杂种优势差异明显,中亲优势最高40.35、最低-51.66;强优势组合中脯氨酸合成关键酶基因P5CS和δ-OAT相对表达量明显高于弱优势组合,分别是弱优势组合的2.10倍、1.87倍;脯氨酸杂种优势与P5CS基因相对表达量在旺长期持续干旱7 d时存在显著正相关关系,与δ-OAT基因相对表达量在伸根期持续干旱14 d、旺长期持续干旱7 d和14 d呈显著或极显著的相关关系,相关系数分别为0.93、0.98和-0.96。结果显示,脯氨酸合成关键酶基因δ-OAT和P5CS的时序性上调或下调表达是相应时期烟草脯氨酸含量性状杂种优势形成的分子基础。     

普通烟草生长素抑制因子NtIAA17的克隆与功能分析

  背景和目的  盐胁迫会抑制作物的生长发育, 从而影响作物的产量和品质。生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白是响应生长素信号的关键因子, 参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫。  方法  为了研究烟草生长素反应基因NtIAA17在烟草生长发育过程中的功能, 以烟草K326为试验材料, 通过克隆获得烟草NtIAA17基因, 利用生物信息学分析其序列特征, qRTPCR技术分析NtIAA17在烟草不同组织及盐胁迫处理0~12 h的表达模式, 利用转基因技术获得过表达NtIAA17-OX(NtIAA17-overexpression)转基因烟草, 对其进行响应盐胁迫的功能鉴定。  结果  NtIAA17基因片段为624 bp, 编码207个氨基酸; 相对分子质量为23.07 kD, 理论等电点为8.24, 该基因启动子区含有顺式作用元件与激素及胁迫相关; 具有Aux/IAA家族蛋白的四个结构域(I-IV)和保守序列。NtIAA17基因与菠菜生长素抑制基因MoIAA13亲缘关系最近; 亚细胞定位分析表明, NtIAA17蛋白是核定位蛋白。qRT-PCR结果表明, NtIAA17基因在茎和老叶中高表达, 盐胁迫2 h时表达量最高。在盐胁迫条件下, NtIAA17-OX转基因烟草与野生型相比, 生物量显著增加, 脯氨酸含量积累增加, 而MDA含量减少, 抗氧化酶基因NtSOD、NtPOD表达量增加。  结论  NtIAA17基因可以响应盐胁迫信号, 通过提高转基因烟草的抗氧化性来抵御盐胁迫带来的伤害, 增加植株的生物量; 本研究为后续耐盐胁迫分子育种提供候选基因和理论依据。      

过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因Sik CDPK1在-4℃低温胁迫处理下的表达量,发现低温胁迫可以诱导天山雪莲内源Sik CDPK1基因表达,且在处理3 h表达量迅速积累达到最高值。将Sik CDPK1基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pCAMBIA2300上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,发现转基因烟草植株在低温胁迫后,耐低温能力明显增强;脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均高于非转基因烟草植株;丙二醛含量和相对电导率均低于非转基因烟草植株。上述研究结果表明,SikCDPK1基因可以通过积累渗透调节物质、增强抗氧化酶活性和维持细胞膜稳定性来提高植物的耐低温能力。     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

烟草中异源表达番茄HQT基因对多酚物质合成的影响

羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT）是催化茄科植物咖啡酰奎尼酸生物合成最后一步的关键酶。为培育富含多酚物质的烟草,提高烟草品质,通过克隆番茄HQT基因,构建P35S：：SlHQT超量表达载体,在野生型三生烟草（SS）中异源表达,利用高效液相色谱技术（HPLC）及液质联用（LC-MS/MS）技术对转基因烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇含量进行检测,探究SlHQT基因对三生烟草一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇物质合成的影响。结果显示,转SlHQT烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸总含量最高可提高14.98倍,芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高11.47和9.32倍,且生长表型与野生型烟草没有明显差异;转SlHQT基因烟草叶片中有4种（1-CQA,3-CQA,4-CQA,5-CQA）一咖啡酰奎尼酸,野生型烟草叶片中只检测到3种（3-CQA,4-CQA,5-CQA）。SlHQT基因在烟草中的异源表达促进了1-CQA的生物合成且提高了一咖啡酰奎尼酸总含量,同时增加了黄酮醇的生物合成。     

烟草miRNA169基因家族及启动子的生物信息学分析

miRNA169是介导植物低温早花的关键因子。为了明确低温诱导烟草miRNA169基因家族表达的调控机制,培育耐低温抗早花的烟草新品种,对miRBase数据库中烟草miRNA169基因数据进行了分析,并对该基因家族及其启动子的结构和功能进行了预测。结果表明:在烟草基因组中共有19个miRNA169基因,分布在1号、8号和9号染色体上,同一染色体上的miRNA169分布集中。除pre-miRNA169t外,其他pre-miRNA169均具有很高的同源性。同时,在所有烟草miRNA169的启动子上均发现低温胁迫应答元件LTR,以及参与低温应答的激素脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的应答元件。因此,推测烟草miRNA169对低温胁迫的响应过程可能是LTR、ABA和JA途径三者共同作用的结果。     

烟草NtSAP5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定

为研究烟草对干旱胁迫的响应机制,克隆了烟草中锌指蛋白基因NtSAP5并对其在干旱胁迫下的表达量进行了检测。结果表明,该基因全长CDS序列为474 bp,编码的蛋白中含有保守的锌指蛋白结构域,该基因NtSAP5的表达受干旱胁迫调控,在干旱胁迫下表达量先升高,后缓慢降低。将NtSAP5的CDS序列克隆到植物过表达载体pG2BW7中,并通过叶盘法转入烟草K326中进行干旱胁迫下的功能验证。选取两个独立的转基因株系及非转基因植株进行干旱胁迫处理,过表达NtSAP5的转基因植株比非转基因植株具有较强的抵御干旱胁迫能力。结果表明,烟草NtSPA5响应干旱胁迫,并在干旱胁迫应答中起到作用。      

采后烟叶碳代谢的动态变化分析

为探究采后离体烟叶内碳代谢的变化规律,以烤烟品种豫烟12号和秦烟96为供试材料,测定采后不同时段烟叶淀粉、总糖和还原糖含量变化,并对淀粉和糖代谢相关基因进行实时荧光定量PCR分析。结果表明,秦烟96采后烟叶淀粉含量显著高于豫烟12号,烟叶采后0~30 h,淀粉含量逐渐下降,总糖和还原糖含量逐渐升高,且糖含量在采后12 h后增加速率变快。秦烟96鲜烟叶中淀粉和糖代谢相关基因的表达量高于豫烟12号,而淀粉分解相关基因Ntα-amylase和Ntβ-amylase表达量低于豫烟12号。烟叶采后30 h内,淀粉合成相关基因NtAGPS1、NtAGPS3和直链淀粉合成关键基因NtGBSS1表达量逐渐下调;支链淀粉合成的相关酶基因表达量变化呈无序增降模式;淀粉分解代谢和糖代谢相关酶基因的表达量或呈先升后降趋势,或呈逐渐上升趋势。NtAGPS1和NtGBSS1表达量变化与采后烟叶中淀粉和糖含量变化相关性显著。同一生态条件下,豫烟12号和秦烟96采后烟叶淀粉和糖代谢规律存在差异,其中NtAGPS1和NtGBSS1可能是采后离体烟叶碳代谢的关键调控基因。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

烟草NtbZIP038的克隆、鉴定及表达模式分析

碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子是植物中数量最多、最具有多样性的基因家族之一,对植物生长发育及胁迫响应具有重要作用。为探究烟草中bZIP转录因子的生物学功能,本研究在烟草K326中克隆得到一个bZIP转录因子基因NtbZIP038,并对其保守结构域进行分析,利用qRT-PCR技术检测了该基因的表达模式,进一步结合亚细胞定位及转录激活试验对其功能进行了初步鉴定。结果表明,NtbZIP038含有典型的bZIP结构域,亚细胞定位于细胞核中并具有转录激活活性。表达模式分析表明,NtbZIP038在根中表达量最高（p<0.001）,并在盐、干旱、冷、热、脱落酸（ABA）等非生物胁迫下都有明显的表达量变化,在ABA处理下尤其明显（p<0.001）。因此,作为bZIP家族中的一员,NtbZIP038转录因子可能在烟草根系发育、ABA响应与非生物胁迫中扮演着重要的角色。     

烟草NtbHLH112基因的克隆、鉴定及表达模式分析

bHLH转录因子在植物响应逆境胁迫过程中起着极为重要的调控作用,克隆和验证烟草中bHLH相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究从普通烟草品种K326中克隆出一个NtbHLH112基因,通过生物信息学方法分析了NtbHLH112功能结构域,利用亚细胞定位及转录激活试验进行了功能鉴定,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,NtbHLH112具有典型的bHLH结构域且进化较为保守,定位在细胞核,具有转录激活的活性。进化分析表明,NtbHLH112与番茄SlbHLH112和辣椒CabHLH112同源。表达模式分析表明,NtbHLH112基因具有组织表达特异性,在叶部表达量较高,并且受到盐、干旱、冷胁迫及ABA处理诱导。因此,NtbHLH112转录因子可能在烟草非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。     

Cams1基因在烟草上的同源克隆及生物信息学分析

为拓宽烟草不育基因的来源,依据辣椒雄性不育基因Cams1序列,在烟草品种K326中同源克隆获得基因Ntms1,采用生物信息学方法对辣椒Cams1基因和烟草Ntms1基因的核苷酸序列、蛋白质结构、亲疏水性及结构域等进行分析,并利用CRISPR/Cas9技术对Ntms1基因功能进行了验证。结果表明,Cams1基因和Ntms1基因的蛋白质序列相似度为85.25%,基因编码产物具有相同的PHD功能结构域,都具有磷酸化识别位点,有相似的二级和三级蛋白质结构,且两个基因都没有信号肽和跨膜区的结构,推测烟草Ntms1基因与辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。遗传转化结果表明,突变株的Ntms1基因表达量和有活力花粉量极显著低于野生型植株,证明了烟草Ntms1基因具有控制烟草花粉育性功能。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

烤烟烟碱转运蛋白基因与烟碱积累的相关性研究

解析烟碱转运相关基因对烟碱积累的影响,可为定向改良烟碱性状提供理论指导。本研究对7份烟碱含量不同的烤烟进行水培,检测打顶前后烟碱含量、烟碱合成基因（NtPMT、NtQPT）、烟碱转运基因（NtNUP1、NtJAT1/2、NtMATE1/2）以及囊泡运输调节基因（NtGEF）的表达量变化。经相关分析、主成分分析和相关网络分析表明：（1）烟碱合成基因NtPMT、NtQPT与烟碱转运基因NtNUP1、NtMATE1/2相互促进表达;（2）根部和叶部的主效烟碱转运基因中,NtJAT1是腰叶的主要烟碱转运基因,NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2在根部对烟碱转运都有贡献,且转运效率依次递减;（3）囊泡运输调节因子NtGEF也能间接影响叶部烟碱积累。因此,在对烟碱性状进行定向改良时,可考虑烟碱合成、转运以及囊泡运输调节因子对烟碱积累的贡献大小。     

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。