应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。     

新型耐碱蛋白A介质的制备与性能

以蛋白A结构中耐碱性更好的C区为基础，构建一种新型耐碱蛋白A，并偶联至琼脂糖基质，获得新型耐碱蛋白A亲和层析介质，分别用激光共聚焦显微镜和石英晶体微天平研究了人免疫球蛋白(hIgG)与蛋白A介质的结合过程。结果表明，该介质具有较商品配基更高的结合力和稳定的再生性能，hIgG动态载量达62.0 mg/mL，40次再生操作后载量为初始载量的84%。该介质在抗体纯化领域具有较好的应用前景。     

链球菌蛋白G免疫球蛋白结合域C3区串联体的表达、筛选与初步应用

筛选并制备高效结合抗体的重组蛋白G亲和层析介质。以链球菌蛋白G C3区为结构单元,拼接形成3、4、5、6个重复C3片段的串联体,分别克隆至PET21,并在E.coli BL21(DE3)中表达。经Ni~(2+)纯化的重组蛋白分别偶联至Purose 4 Fast Flow制备亲和层析介质,比较介质的吸附情况,发现重组四串体对h IgG的吸附量最高,其静态饱和吸附量为66.79 mg×mL~(-1),动态吸附载量为35 mg×mL~(-1)介质,优于同类型商品介质。利用该介质分离纯化小鼠腹水和人血清中的IgG,纯度在95%左右,回收率不低于80%。     

多肽配基亲和吸附介质的配基密度控制规律

以谷胱甘肽为配基,琼脂糖微球为骨架,探索将谷胱甘肽通过共价键偶联到琼脂糖微球骨架上,制备可以分离谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)及以其为标签的融合蛋白的亲和吸附介质.采用正交实验方法考察了谷胱甘肽加入量、偶联缓冲液的pH值和反应温度对亲和介质配基密度的影响.结果发现,该反应过程中的pH值对配基密度影响最大,其次为谷胱甘肽的加入量.用所制备的亲和吸附介质纯化GST(大鼠肝脏谷胱甘肽S转移酶),发现GST的吸附量随配基密度增加而增加,但GST活性却随配基密度的增加而下降,较好的干胶配基密度为260 μmol/g.大鼠肝匀浆液经过离子交换和亲和层析两个步骤,获得了电泳纯的GST,比活力为12.08 U/mg,总活性回收率为40%以上.     

固定化金属亲和层析介质在蛋白纯化中的应用进展

随着生物制药技术的发展,生物制品的生产规模日益扩大,对下游分离纯化技术也提出新的挑战,为满足高效获得符合要求的产品这一需求,各种快速分离纯化蛋白的技术应运而生,其中固定化金属亲和层析色谱在蛋白纯化中的应用取得了快速发展。固定化金属亲和层析具有配基选择简单且稳定性高、特异性好、蛋白结合载量高、蛋白洗脱条件温和、介质易再生、制备工艺简单、造价低等多项优点,逐渐成为蛋白质分离纯化及多个相关领域中最有效的分离技术之一。本文对固定化金属亲和色谱的工作原理、构成、应用现状进行了阐述,其中主要对蛋白载量和金属离子泄露问题进行概括,对螯合层析介质在蛋白质纯化中的前景进行了展望。     

静电耦合亲和层析纯化人血清白蛋白的研究

人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是人血清中含量最丰富的蛋白，约占血清总蛋白含量的40%～60%。商品化的白蛋白亲和介质(Cibacron Blue F3GA)的配基毒性大、易脱落、载量低，纯化白蛋白回收率较低。本研究制备了一种新型静电耦合亲和介质(DASA-Sepharose,3,5-Diaminobenzoic Acid n-Octyl Succinic Anhydride-Sepharose)，并通过一步层析从人血清中高效纯化白蛋白。DASA-Sepharose介质采用3,5-二氨基苯甲酸间隔臂将正辛基琥珀酸酐亲和配体偶联于琼脂糖微球。DASA-Sepharose间隔臂上的羧基通过静电作用吸附白蛋白，进而与正辛基琥珀酸酐亲和配基协同作用实现静电耦合亲和吸附，在保持亲和吸附高特异性的同时大大提高了吸附载量。采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)为模型蛋白考察了Na Cl浓度和溶液pH对介质静态吸附载量(Q_m)的影响，NaCl浓度为0.025～0.06 mol/L时Q_m几乎不受影响，...     

壳聚糖微珠亲和层析介质的制备及其初步应用

目的制备壳聚糖(CTS)微珠亲和层析介质,并进行初步应用。方法采用多种化学方法对CTS的表面基团进行改造,使其活化。用此改性CTS进行羊抗人IgG及小牛血清纤维连接蛋白(FN)的纯化。结果此改性的CTS微珠粒径在40￣160μm之间,每克可溶胀至4ml。活化的CTS对人丙种球蛋白的吸附量为15￣25mg/gCTS,对明胶的吸附量为5.8￣6.5mg/gCTS。采用此方法纯化的羊抗人IgG及FN与Sepharose4B法纯化效果一致。结论已制备的壳聚糖微珠亲和层析介质,其性质稳定且价格较低,是一种可以广泛应用的亲和层析介质。     

重组G145R HBsAg亲和纯化方法的建立及其应用

目的建立重组乙型肝炎病毒G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法。方法用抗-HBs单克隆抗体(D12- McAb)制备亲和层析胶,对2A8细胞(分泌G145R变异HBsAg)培养上清盐析物进行亲和纯化。采用SDS-PAGE、Western blot及ELISA,对纯化产物的纯度、特异性、含量和回收率进行鉴定,并与同法纯化的HBsAg阳性血清及r-wHBsAg提取物进行比较。结果D12-McAb对重组真核表达G145R变异HBsAg、HBsAg阳性血清及r-wHBsAS三者具有相似的亲和性,产物纯度分别为90.3%、95.2%和93.1%,回收率分别为43.3%、72.0%和66.4%。结论已成功地建立了重组G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法,为G145R变异以及其他HBV免疫逃逸变异感染的深入研究奠定了重要的技术基础。     

Cu~(2+)-IDA金属螯合尼龙-壳聚糖复合膜的制备及其亲和分离性能研究

为获得既具有良好机械强度和化学稳定性又具有大量活性官能团的金属螯合亲和膜介质,以尼龙膜为基膜,采用环氧氯丙烷活化共价偶联壳聚糖,制备尼龙-壳聚糖复合膜,膜上偶联壳聚糖的含量达98.2 mg·(g膜)-1,为配基的固载提供了大量活性位点.再次采用环氧氯丙烷活化复合膜,进而偶联亚氨二乙酸(IDA)、固定化Cu2+,获得金属螯合尼龙-壳聚糖复合型亲和膜,配基Cu2+固载量为5.4μmo1·cm-2.以牛血清白蛋白为目标蛋白,考察亲和膜的分离性能.研究结果表明:牛血清白蛋白在膜上的吸附行为符合Langmuir吸附等温方程,膜对牛血清白蛋白具有较好的亲和吸附效果,吸附容量达1.09 mg·cm-2.该膜具有较长的使用寿命并且容易再生.     

国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B亲和层析分离羊抗人IgG的比较

目的比较国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B两种不同介质偶联人免疫球蛋白纯化羊抗人IgG的差别。方法采用亲和层析的方法纯化羊抗人IgG,通过血凝实验检测不同介质纯化产物的效价和特异性。通过SDS-PAGE检测其纯度。通过计算偶联率及蛋白回收率,比较两种介质纯化效率。结果两种不同介质纯化的羊抗人IgG特异性良好,效价均为1∶512,SDS-PAGE检测均为单一条带。采用两种介质纯化羊抗人IgG,蛋白回收率分别为10·03%和17·45%。结论两种不同介质采用亲和层析方法纯化均可获得纯度较高的羊抗人IgG。     

改进葡聚糖接枝技术制备高性能层析介质

利用改进的葡聚糖接枝技术,在以环氧氯丙烷为交联剂交联琼脂糖微球骨架的过程中加入葡聚糖溶液,在交联的同时接枝葡聚糖制得葡聚糖接枝型琼脂糖微球Rigose-Dex,再与盐酸2-氯三乙胺（DEAE）反应,获得葡聚糖接枝型高载量弱阴离子交换介质Rigose-Dex DEAE。以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白,以商品化介质DEAE Sepharose 6FF为对照,系统研究了该葡聚糖接枝型Rigose-Dex DEAE的蛋白吸附性能,并进行了物理性能研究。结果表明,改进后葡聚糖接枝技术的最高接枝量为24.5mg/mL。自制Rigose-Dex DEAE可耐受700cm/h 的线性流速,对BSA的动态饱和载量为127.6mg/mL, 为商品介质DEAE Sepharose 6FF 载量的212%;具有在高流速下快速结合蛋白的能力,上样蛋白溶液在层析柱中停留2min即可基本达到饱和动态载量;重复使用性能好,经120 次在线清洗后,Rigose-Dex DEAE介质的动态载量为原始载量的90.4%。     

重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的　探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法　将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果　融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论　已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。     

席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点,广泛应用于蛋白分离纯化,本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,肝素为配基,利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成,首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H₂SO₄水解为邻羟基,然后将邻羟基氧化为醛基,最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白,主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白结合容量的影响规律,包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等,建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态结合容量可达40.3 mg/mL,比商品GP-肝素介质高约36%,经1.0 mol/L的氯化钠洗脱,其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌,观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8～318 cm/h)下的动态结合容量,发现操作流速提高10倍后介质结合容量仅下降12%。经10次重复使用后,动态结合容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白,结果表明具有良好的分离效...     

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。     

新型亲和配体的筛选

一、引言在基因工程药物的研制中 ,为了生产出高纯度、高活性的蛋白药物 ,研究经费的 30 %需花费在分离纯化工艺的研究上 ;在商业生产中 ,分离纯化阶段的平均生产费用占产品总生产成本的 60 %～ 70 % ,即使这样仍然很多生物技术药物找不到经济可行的纯化工艺[1] 。传统蛋白药物的分离纯化是利用目标物质与杂质的性质 ,如溶解度、分子大小、电荷性质、疏水性质、专一识别序列及结合位点等进行分离。通常采用的方法有 :沉淀法、萃取和抽提、分子筛凝胶层析和超滤、阳离子和阴离子交换凝胶层析、疏水凝胶层析及亲和凝胶层析等方法。随着对蛋白…     

适应高滴度抗体制备的抗体捕集纯化技术研究进展

抗体捕集纯化是单克隆抗体和Fc融合蛋白药物制备过程的关键步骤。但相较于大规模动物细胞培养技术的迅猛发展，抗体的捕集纯化已经成为了制约单抗药物生产的主要“瓶颈”。本文回顾了蛋白A亲和层析和阳离子交换层析等当前抗体药物工业生产过程主要捕集纯化技术的发展现状和应用情况，介绍了近年来亲和肽层析和混合模式吸附层析等新型层析分离技术的发展以及膨胀床吸附和多柱串联吸附等过程集成方法在提高抗体捕集效率方面所展现的良好前景。在此基础上，指出了影响抗体捕集纯化的主要因素以及各技术发展中存在的问题，展望抗体捕集纯化技术的发展方向。     

人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析

目的　制备纯化人组织激肽释放酶 ,并检测其生物活性 ,为中试放大及纯化工艺奠定基础。方法　使用麦芽糖 (MBP)融合分泌载体pMBP P ,构建并筛选出 1株工程菌株 ,在 6L培养基中经IPIG诱导表达人组织激肽释放酶融合蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化及凝血酶切割后 ,采用电位滴度法测定其活力。结果　筛选出的工程菌株表达相对分子质量约 70 0 0 0的激肽释放酶融合蛋白 ,大小与预计大小相符。纯化后共获得 2 8mg蛋白 ,并具有水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力。结论　成功进行了人组织激肽释放酶融合成熟蛋白的小量制备 ,经纯化后的产物具有生物活性 ,为中试放大、纯化工艺研究奠定了基础。     

木瓜蛋白酶在染料Cibacron Blue F3GA纤维素亲和膜上的吸附研究

以纤维素滤纸膜为载体,染料Cibacron Blue F3GA为配基,制备了一种新型亲和膜色谱介质。采用扫描电镜、红外光谱、元素分析等方法对亲和膜介质进行鉴定与表征,该膜具有良好的色谱性能。亲和膜对F3GA的键合质量摩尔浓度达93.7μmol/g。研究了木瓜蛋白酶在亲和膜上的吸附行为,实验表明:在30℃下、酶质量浓度为2 mg/mL、pH=8.0时,吸附质量比可达57.9 mg/g,改变pH值及离子强度等条件对吸附质量比有明显的影响。在最适条件下吸附遵循Langmuir型吸附。可以初步推断,纤维素滤纸膜可以制成性能优良的亲和膜色谱介质,成本低廉,适合工业化分离纯化生物大分子。     

应用固定化金属亲和层析纯化His6融合甲状旁腺激素相关蛋白

应用原核细胞高效表达载体在大肠杆菌表达了N端带 6个组氨酸的重组人PTHrP。利用其对金属鳌合层析介质的亲合性 ,采用含盐咪唑梯度洗脱 ,一步纯化即可得到纯度大于 90 %且具有生物学活性的重组PTHrP ,并进一步制备了抗PTHrP单克隆抗体。应用His6纯化标签的固定化金属亲和层析 (IMAC) ,极大地方便了目的蛋白的纯化 ,为进一步研究PTHrP的生物学特性及其在临床诊断治疗中的应用奠定了基础。     

重组Flag-pA-Tn5蛋白的原核表达及酶活性鉴定

目的 构建Flag-葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5,在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白,并检测其转座酶活性。方法 合成Flag-pA基因的DNA编码序列,PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5,构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5;转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达带有Flag标签的pA-Tn5蛋白,并经几丁质树脂亲和纯化后透析复性;将Flag-p A-Tn5蛋白与含测序引物接头的转座子DNA片段组装成转座体,取不同稀释比例的转座体与人外周血白细胞基因组DNA共孵育,以DNA孵育产物为模板、测序引物进行PCR扩增,鉴定Flag-pA-Tn5转座酶活性。结果 重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白产量为211.1μg/mL,能够被几丁质树脂亲和纯化,纯度为84%;Flag-pA-Tn5蛋白与转座子DNA片段组装后,能有效切割人外周血白细胞基因组DNA,并连接测...