肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制

目的：为满足肠道集聚性大肠埃希氏菌准确检测的实验室质量控制和能力验证需求，研制具有我国自主知识产权且具有全基因组测序信息的均匀稳定的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质。方法：利用二代高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌（CMCC 44841）进行全基因组测序，明确CMCC 44841的种属、血清分型、多位点序列分型和毒力基因。对CMCC 44841进行astA、aggR、pic特征性基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球和含量为20 ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对20 个菌球样品进行均匀性检验，采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于－20、4、25 ℃和37 ℃条件下保藏，对其贮藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织3 家实验室进行协同标定和验证。使用5 种不同基质的即食食品样本，按照国标法检验标准物质的适用性。结果：利用生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057 285 Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5 173 个。种属鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），血清预测结果为O127:H21，MLST为ST40型，携带除aggR、astA、pic之外其他相关的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片段大小分别为102、400 bp和1 111 bp。菌体标准物质均匀性检验结果F=1.59，符合标准物质的要求。菌体和gDNA标准物质样品于－20 ℃和4 ℃保藏60 d，25 ℃保藏7 d，37 ℃保藏5 d后仍然稳定。经3 家实验室协同标定，菌体标准物质样品含量均为103 CFU/样品。20 件不同基质的食品样品加入肠道集聚性大肠埃希氏菌标准物质进行检验，均可以检出。结论：本研究所制备的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质所用菌株来源于我国国内分离菌株，且具有明确的全基因组序列信息，均匀性和稳定性均符合要求，适用性良好，能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的制备方法, 研制均匀稳定的标准物质,用于实验室内部质量控制。方法采用冷冻干燥技术制备含量为4-5×104CFU/样品的菌球,参照《CNAS-GL29：2010标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,随机抽取20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20℃、4℃、25℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。并组织3家实验室进行协同标定,再使用20件食品作为基质,按照国标法检验大肠埃希氏菌标准物质的适用性。结果对20瓶标准物质的均匀性检测结果进行单因子方差分析： F=1.933, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d,复苏率为96.2%;在4 ℃保藏14 d,复苏率为77.0%;25 ℃保藏7 d,样品中菌含量仍保持在104CFU/样品的水平,说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在104CFU/样品水平,生化鉴定结果均符合大肠埃希氏菌的特征;标准物质加入到20种食品基质中, 均可以检出大肠埃希氏菌,活菌含量仍保持在104CFU/样品的水平。结论本研究所制备的大肠埃希氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中大肠埃希氏菌检测结果的评价。     

食品检测用产肠毒素大肠埃希氏菌标准物质的制备及评价

目的 制备并评价产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）标准物质。方法 分别用基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOF MS）、生化、16 s RNA基因序列测定三种方法确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备600个ETEC标准样品（103CFU/样品）;从中随机抽取20个进行均匀性检验;模拟25℃和37℃的运输温度测试样品的运输稳定性,同时在4℃和-20℃的条件下进行保藏稳定性检验。组织3家实验室对样品进行协同验证。最后选择20件食品基质来验证样品的使用效果。结果 生化、MALDI-TOF MS、16 s RNA基因序列鉴定CMCC(B)43208为大肠埃希氏菌,lt、stp、sth基因确认其为ETEC。均匀性检验中,单因素方差分析得F=1.48,小于FINV(0.05,19,20)。稳定性检验中,在25℃和37℃保藏7 d后结果为103CFU/样品,在-20℃保藏60 d和4℃保存28 d后结果为103CFU/样品。协同标定实验中,3家实验室检测样品中菌株均为ETEC(103CFU/标准样品)。使用效果评价中,ETEC标准样品加入20种食品基质后均可检出,而本底对照均未检出。结论 本实验制备的...     

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的 为满足实验室酵母菌日常检验质量控制需求及实验室间比对,制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质。方法 通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及ITS位点测序对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,刮取适宜菌苔于保护剂中混匀后冻干,制备10_⁴ CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.15,将研制的本标准物质加入7类食品基质共20件样品中进行检验,验证真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对本标准物质进行协作标定。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序结果与NCBI Genbank中已有序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica(Accession number ：CP061015.1;Query Cover：95%;Ident：100%)。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析计算F_0.05(19,20)=2.137,F值为1.697,F＜F_0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃培养箱中放置7天,标准物质中菌含量仍保持在10_⁴ CFU/样品,可保持稳定。标准物质于4 ℃储存28天及-20 ℃储存90天,菌含量为10_⁴ CFU/样品,复苏率均在91%以上,说明4 ℃放置较短时间及-20 ℃放置较长时间样品稳定。7类食品样品基质中加入本标准物质后进行检验,均可检出,回收率为81.3%。经三家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0～3.0×10_⁴ CFU/样品。结论 本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌定性检验,今后可作为实验室日常检验工作的阳性对照质控样品,也可作为实验室间比对样品发放,以保障日常检验工作结果可靠性,进一步提升检验机构人员的检验水平。     

食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的制备方法,研制均匀稳定的标准物质。方法利用冷冻干燥法制备103 CFU/样品的标准物质,参照CNAS-GL 29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,抽取20件样品,利用平板计数法测定标准物质的均匀性,并对结果进行统计分析;将样品分别置于-20、25、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定,使用30种即食熟肉制品作为基质,并按照国标法检验标物物质的适用性。结果采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=0.922,符合标准物质的要求。标准物质在-20℃保藏28 d, 25、37℃保藏7 d,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均在103 CFU/样品的水平;标准物质加入到30种即食熟肉制品中,均可以检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论本研究所制备的单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的评价。     

食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价

该研究制备并检测了不含基质的副溶血性弧菌标准物质。用质谱、生化、16S RNA基因序列测定3种方法对菌株CMCC20030分别确认种属。先采用冷冻干燥技术制备800个样品[103 CFU/样品(20 μL)]。然后随机抽取20个样品进行均匀性检验;再将样品存放25、37 ℃分别在1、3、5、7 d取出进行运输稳定性检验,将样品存放4 ℃分别于7、14、28 d进行短期保藏性检验,将样品存放-20 ℃分别于14、28、60 d的保藏稳定性检验。组织5家实验室对样品进行协同标定。最后用食品基质检测使用效果。菌株CMCC20030经3种方法均鉴定为副溶血性弧菌。均匀性检验中,F样品=1.930,小于FINV（0.05,19,20）。稳定性检验中,于-20 ℃保藏60 d、4 ℃保存28 d、25 ℃保藏7 d和37 ℃保藏3 d后,活菌含量103 CFU/样品。协同标定实验中,5家实验室结果均为103 CFU/样品。使用效果实验中,20种食品基质加入样品后均可以检出,本底对照均未检出。制备的不含基质的副溶血性弧菌样品满足标准物质要求,可依据不同目的灵活使用。     

食品检测用鼠伤寒沙门氏菌标准物质的研制

目的 研制均匀稳定的鼠伤寒沙门氏菌标准物质。方法 采用冷冻干燥技术制备含量为1.5-2.0×103 CFU /样品的菌球, 参照CNAS—GL29: 2010《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》, 随机抽取22件样品进行均匀性检验, 采用单因素方差分析对结果进行统计分析, 将样品分别于-20、4、25、37 ℃条件下保藏, 对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价, 并组织3家实验室进行协同标定, 再使用45件食品作为基质, 按照国标法检验鼠伤寒沙门氏菌标准物质的适用性。结果 对22件标准物质的均匀性检测结果进行单因素方差分析, F=1.986, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d, 复苏率为103.1%; 在4 ℃保藏28 d, 复苏率为102.0%; 在25 ℃保藏14 d或者37℃保藏7 d, 样品中菌含量仍保持在103 CFU/样品的水平, 说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在103 CFU/样品水平, 生化鉴定结果均符合沙门氏菌的特征; 标准物质加入到45种食品基质中, 均可以检出沙门氏菌。结论 本研究所制备的鼠伤寒沙门氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求, 适用性良好, 可用于食品检测实验室的质量控制和食品中沙门氏菌检测结果的评价。     

鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102即用型标准菌株的研制

目的 研制鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102即用型标准菌株。方法 对高、低浓度鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102的冻干菌株进行计数，测定了增菌3、5、7、18 h后冻干菌的自发回变率，依据CNAS-GL003 2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》（CNAS-GL003）和GB 15193.4—2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》（GB 15193.4—2014），测定即用型标准菌株的均匀性、储藏和运输稳定性、自发回变率和诱变剂突变率。比较20株即用型标准菌株和新鲜菌株的自发回变率和诱变剂突变率测试结果的标准偏差。结果 高浓度冻干样品浓度为10⁷~10⁸ CFU/样品，低浓度样品浓度为10⁵~10⁶ CFU/样品；增菌18 h后自发回变率的结果基本符合GB 15193.4—2014要求；4株即用型标准菌株的均匀性结果的F值分别为1.12、1.05、1.68、1.38，F<F_0.05（19，20），符合CNAS-GL003要求。4株冻干菌株在25 ℃ 5 d、4 ℃ 14 d、-20 ℃ 6个月的储存条件，检测结果符合储存和运输稳定性要求。20株即用型冻干标准菌株的自发回变率较新鲜菌株标准偏差小。结论 本研究研制出适用于Ames试验的即用型标准菌株，其均匀性、储存和运输稳定性良好，自发回变的稳定性优于新鲜菌株。     

3种致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒的研制与效用评价

本研究为了研制一种多重PCR检测试剂盒,用于对肠道致病性大肠埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）、产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shigatoxin-producing E. coli,STEC）和肠道出血性大肠埃希氏菌（Enterohemorrhagic E. coli,EHEC）3种DEC（Diarrheagenic E. coli,DEC）的快速检测。优化所涉及的多重PCR检测体系和构建相应的检测试剂盒,其中的主要检测试剂采用冻干工艺,评价该试剂盒的检测特异性、灵敏度、重复性以及保质期。结果表明,本研究成功建立了针对于3种DEC的检测体系EP和检测体系ST;3种DEC标准菌株和分离菌株均出现明显的目标基因条带,而其他种类DEC标准菌株和分离菌株均未出现目标基因条带;该试剂盒检测管EP和检测管ST的检出限分别可达到1.5×103 cfu/mL和2.1×103 cfu/mL,且二者检测重复率均为100%;该试剂盒可在4 ℃条件下保存12个月,也可在42 ℃环境运输120 h,期间其检测效力不受影响。本研究研制的试剂盒性能好,检测结果稳定、可靠,适用于食品中3种DEC的快速检测。     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

Detection of Escherichia coli O157 in bovine meat products in northern Italy

Tests for Escherichia coli and E. coli O157 were carried out on meat samples collected from randomly chosen stores throughout the city of Bologna and suburban areas. The samples consisted of 25 g of loose minced beef, sometimes already shaped into meatballs or hamburgers, some of which were mixed with vegetables. The meat was purchased from retail outlets, open market stalls, and supermarket chains during 25 sampling visits from October 2000 to December 2001. For E. coli detection, Tryptone soya broth (TSB) supplemented with novobiocin and C-EC agar were used. Immunomagnetic separation with SMAC-BCIG-CT agar and chromogenic E. coli O 157 agar, API 20E system and agglutination latex test were used to detect E. coli O157; Vero cell assay and polymerase chain reaction (PCR) were used to assess toxin production and the presence of virulence genes.

E. coli were detected in 45 (30.2%) of the 149 samples examined, mainly in the hamburger samples mixed with vegetables and in the loose minced beef. E. coli O157 was found in one sample of hamburger and two samples of hamburger mixed with vegetables (2%) collected from three different butcher's stores between July and October. All the strains of E. coli O157 and most cases of E. coli were found in meat from small retailers.

The three strains of E. coli O157 were positive for verocytotoxin production. PCR analysis revealed genes coding for vt2 and one strain possessed the gene for eae A. Chromogenic E. coli O157 agar was found to be more selective and differential, allowing easier identification of suspected colonies with mixed flora and producing less false-positive colonies.     

利用EHEC琼脂平板从食物中分离检测产志贺毒素大肠杆菌

为利用肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)琼脂平板,从食物中分离、检测产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC),采用STEC毒力基因(hlyA基因)检测溶血素的产生,建立了一种利用EHEC琼脂平板快速、准确地从食物中分离、检测STEC的方法。该方法可检测STEC不同血清O157∶H7、O26、O111。     

新科斯糖对肠道菌体外生长影响的研究

研究新科斯糖对大肠杆菌和双歧杆菌体外生长的影响。结果表明,以葡萄糖和普通低聚果糖为对照,大肠杆菌在新科斯糖上的生长相对弱一些,但差异不显著(p>0.05);双歧杆菌能很好的利用新科斯糖在体外生长,是利用普通低聚果糖增殖效果的1.4倍,葡萄糖的2倍。     

二氧化氯(ClO2)对葡萄表面大肠杆菌杀灭效果的研究

用CiO2溶液浸泡已接种大肠杆菌的葡萄,观察处理时间、ClO2溶液体积与葡萄质量之比(v/m)、ClO2浓度对杀菌效果的影响.结果表明:处理时间从5min延长到10min杀菌效果上升2.35±0.18log,但进一步延长处理时间上升趋势变缓;v/m为2时的杀菌效果低于其为3、4、5时的杀菌效果,后3者之间无显著性差异(P＞0.05);ClO2浓度在很大程度上影响着杀菌效果,ClO2浓度增加杀菌效果明显提高.     

食品中大肠杆菌的快速检测方法

大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌,食物或水中大肠杆菌的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标;而且他在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近,它的出现也可能预示某些肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌,因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要,相应出现了大量的大肠杆菌的各种检测方法。     

大肠杆菌工程菌产木聚糖酶工艺优化及酶学性质研究

对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在pH 2.5磷酸盐缓冲液中释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液中释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶的最适pH值为6.4,最适温度为55℃。该酶具有较好的热稳定性,含水分17%的酶在90℃条件下2.5min仅失活13.6%。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。     

2007-2009年欧盟肠出血性大肠杆菌监测简介

2007—2009年欧盟平均每年报告3 213例肠出血性大肠杆菌病例,平均每年溶血性尿毒综合征患者185例,血清型以肠出血性大肠杆菌O157为主。食品与牛粪便中分离的肠出血性大肠杆菌血清型以O157为主。2007—2009年鲜牛肉肠出血性大肠杆菌O157分离率分别为0.1%、0.1%和0.7%,牛粪便中肠出血性大肠杆菌O157分离率分别为2.9%、0.5%和2.7%。     

生物合成对香豆酸大肠杆菌工程菌的构建

对香豆酸是一种具有预防心血管疾病、抗氧化和抗菌消炎等生物活性的酚类物质,同时,它也是高价值苯丙烷类保健营养品(如白藜芦醇)的前体。本研究希望创制出一种生物合成对香豆酸的方法,以缓解对香豆酸的供求问题。把带有粘红酵母(Rhodotorula glutinis)酪氨酸解氨酶(Rg TAL)基因的组成型表达载体转化大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组菌株。对重组菌株进行发酵培养,对发酵液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成对香豆酸的能力。随后通过优化L-酪氨酸的添加量和工程菌的发酵时间,最终确定,底物L-酪氨酸的添加量为0.5 m M,发酵时间为36 h,检测发酵液中的对香豆酸含量最高,为161.23 mg/L。这表明,Rgtal基因在重组大肠杆菌中成功得到了表达,并且能利用自身代谢和外源添加的L-酪氨酸生物合成对香豆酸。     

大肠杆菌cdd和thrA基因的敲除及其对胞苷积累量的影响

以大肠杆菌AU39作为出发菌株,通过基因工程手段对其进行改造,旨在提高胞苷产量。首先,通过Red重组系统敲除了大肠杆菌AU39基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd,阻断了胞苷的分解代谢;敲除了E．coliAU39（Acrid）基因组上的高丝氨酸脱氢酶基因thrA,阻断天冬氨酸向高丝氨酸的代谢途径。然后,分别对不同基因缺失菌株进行培养发酵,与出发菌株E．coliAU39相比,两株突变株都有不同程度的胞苷积累,E．coliAU39（Acdd）与E．coliAU39（AcddAthrA）的胞苷产量提高了1．25倍与1．6倍,而尿苷产量均相对有所降低。     

Bifidobacteria as indicators of faecal contamination in meat and meat products: detection, determination of origin and comparison with Escherichia coli

Faecal contamination of meat and meat products and its origin, whether human or animal, was determined by using the presence of bifidobacteria as an indicator. Enrichment of samples in Beerens liquid selective medium was followed by spreading onto Columbia agar containing paromomycin. In comparison with the detection of Escherichia coli (E. coli) the following results were obtained from 50 samples: E. coli. +; Bifidobacterium. +: 38; E. coli −; Bifidobacterium −: 9; E. coli, +; Bifidobacterium. −: 2; E. coli, −; Bifidobacterium. +: 1. From 39 positives samples, 50 strains of bifidobacteria were isolated. Two were of human origin, 48 of animal origin.